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摘要冠状动脉粥样硬化性心脏病（Coronary Atherosclerotic heart Disease，CAD）是危害人类健康的重大心血管疾病之一，具有起病隐匿复杂、临床表现多样、病情呈持续发展的特点，动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是CAD共同的病理基础。因此，对AS进行有效的早期筛查有助于对CAD病情发展及治疗疗效的判断。血液学检查是临床辅助检查中最为便捷、经济的检查手段，然而，目前应用于AS的早期风险评估和诊断的血清学指标仍然面临诸多挑战，因此需要探索新的血清生物标记物。Metrnl蛋白是本实验室2008年筛选脂肪因子时发现的一个未经报道的新型蛋白。该蛋白分子的生物信息学提示——其氨基酸序列在不同种属（人、小鼠和大鼠）中具有高度相似性：均为N端含有45个氨基酸信号肽序列的分泌蛋白;分子量大小约为34KDa。本实验室前期对Metrnl蛋白的分子量、可分泌性、表达分布以及生物学功能进行了探索。本课题主要探究Metrnl蛋白的分泌方式、影响分泌的相关因素以及血液Metrnl成为评估心血管疾病潜在生物学指标的临床意义。<br>　　目的:<br>　　一、通过体外培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)探究Metrnl蛋白分泌途径及影响分泌的因素。<br>　　二、通过构建Metrnl基因内皮敲除小鼠模型并结合骨髓移植术(Bone Marrow Transplantation，BMT)，明确血管内皮细胞对血液Metrnl蛋白的贡献。<br>　　三、通过构建心肌梗死模型，探究血液Metrnl在心肌梗死(Myocardial Infarction，MI)病理过程中的改变。<br>　　四、通过构建小鼠AS模型并结合主动脉Metrnl免疫荧光染色，探究血液Metrnl在AS病理过程中的改变。<br>　　五、结合动物疾病模型和临床病例探讨Metrnl分泌蛋白可能作为心血管疾病的病情发展血液生物学指标的临床意义。<br>　　方法：<br>　　一、原代HUVECs培养，体外添加ER-Golgi转运途径抑制剂：布雷菲德菌素（Brefeldin A，BFA：5μg/mL）、EeyarestatinⅠ(5μg/mL)、衣霉素(Tunicamycin，Tm：2μg/mL)以及致内皮细胞损伤化合物：脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、氧化低密度脂蛋白（Oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）、胆固醇(Cholesterol)。收集无血清培养细胞培养上清液进行Metrnl蛋白的ELISA测定，明确Metrnl蛋白分泌途径以及致内皮损伤因素对内皮细胞Metrnl分泌的影响。<br>　　二、采用Cre-LoxP重组酶系统，根据Tek基因特异表达血管内皮细胞，启动内皮细胞的Cre酶剪切LoxP位点之间的相关Metrnl基因序列的特点，构建Tek-Metrnlloxp/loxp(KO)小鼠，繁殖培育获得相应的野生对照小鼠(Metrnlloxp/loxp，WT);比较KO与WT两组小鼠Metrnl在血液蛋白水平以及主动脉（含内皮细胞）mRNA水平上的差异，明确内皮细胞能够分泌Metrnl蛋白的特性，并探究血管内皮细胞分泌的Metrnl是否为血液Metrnl的主要来源。<br>　　三、提取KO和WT两组供体小鼠骨髓细胞制成单细胞悬液，通过尾静脉注射至经60Coγ射线全身照射10min的C57受体小鼠建立骨髓移植模型，并采用流式细胞技术明确骨髓移植的效率。通过核酸水平(包括DNA和mRNA)的检测，明确Tek启动子对骨髓Metrnl表达的影响;并通过ELISA测定受体小鼠血清Metrnl含量明确骨髓对血液Metrnl的影响。<br>　　四、采用冠状动脉左前降支结扎法建立小鼠4h和24h单纯心肌梗死模型，并借助气体麻醉装置和无创心电图(Electrocardiogram，ECG)对模型建立方法进行优化和评估;氯化三苯基四氮唑染色法（Triphenyl tetrazolium chloride，TTC）明确梗死范围;ELISA测定血清Metrnl判断MI发展对Metrnl血液水平的影响。<br>　　五、利用ApoE-/-小鼠构建两种不同严重程度的AS小鼠模型（自发性AS;高脂喂养5个月的加重型AS），分离血清并利用ELISA法检测Metrnl含量，探讨AS病程进展与血液Metrnl的相关性;通过分离AS模型小鼠的主动脉并对AS区和非AS区Metrnl和内皮标记分子CD31进行免疫荧光染色，探讨Metrnl蛋白的分布情况。<br>　　结果：<br>　　一、Metrnl蛋白的分泌由信号肽介导的，并通过依赖于内质网-高尔基体（Endoplasmic reticulum-Golgi,ER-Golgi）的经典分泌途径;抑制糖基化修饰不影响HUVECs对Metrnl蛋白的分泌，验证了人Metrnl蛋白不含糖基化位点的生物信息学结果;Metrnl蛋白的分泌具有持续性，随细胞培养时间的延长分泌量逐渐增大;致内皮损伤因素刺激HUVECs(≤16h)能够促进Metrnl蛋白的分泌，且可能在早期(LPS刺激1h)更明显。<br>　　二、血管内皮细胞分泌的Metrnl蛋白是血液循环中Metrnl蛋白的主要来源;Tek-Cre酶系统可以明显降低(80％～90％)骨髓来源Metrnl基因的表达，但骨髓细胞Metrnl基因表达的下降并不影响血液Metrnl蛋白的含量。<br>　　三、血液Metrnl水平随AS病情加重呈明显下降趋势;免疫荧光结果显示，Metrnl与主动脉内皮细胞共定位表达，且在AS区Metrnl表达明显下降，提示Metrnl的分泌随AS的进展下降，且Metrnl蛋白组织水平表达反映内皮细胞功能;血液中Metrnl蛋白可能成为AS进展的有效生物指标。<br>　　四、具有临床心梗诊断患者的血液Metrnl水平较其对照组明显下降，提示血液中Metrnl分泌蛋白与CAD有一定相关性。<br>　　五、单纯MI动物模型中，在心肌损伤4h和24h两个时间点，手术与假手术两组小鼠的血液Metrnl水平之间没有差异，提示单纯MI所致急性心肌坏死并不影响血液Metrnl水平。<br>　　结论：<br>　　Metrnl蛋白可由血管内皮细胞分泌，其分泌途径依赖于信号肽介导的ER-Golgi经典分泌途径;血管内皮细胞而非骨髓细胞来源的Metrnl蛋白是循环血液中Metrnl蛋白的“主力军”。<br>　　内皮损伤因素可以促进内皮细胞对Metrnl蛋白的分泌，且在刺激早期(≤1h)效果显著;血液Metrnl水平随AS病程进展而显著下降，且合并AS的MI患者的血液Metrnl水平也显著下降;MI是AS不断发展导致斑块破裂诱发血栓形成进一步堵闭血管，造成心肌细胞的缺血坏死，然而在单纯MI动物模型中，血液Metrnl水平并没有受到该病理改变的影响。因此，循环血液中Metrnl的变化与AS的发生发展相关;在AS的发生发展过程中，内皮细胞受损导致功能失调以及炎症的破坏是至关重要的一环。进一步提示血管内皮细胞分泌的Metrnl可能是内皮细胞功能的一个指示标记。对临床AS的发展进程的预测具有指导作用。<br>　　本课题首次研究了Metrnl分泌蛋白的分泌途径;明确了血液中Metrnl蛋白主要来源于血管内皮细胞分泌;建立心血管疾病动物模型并结合临床数据，探究了Metrnl分泌蛋白作为评估AS发生发展以及预测临床CAD风险的血液学检测分子指标的重要临床价值。