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摘要国际癌症研究中心发布的数据显示，2018年全球新增1810万癌症病例，死亡人数达960万，形势不容乐观。传统治疗肿瘤的方法如放疗、化疗都存在很多的局限性和副作用，因此，寻找和开发更有效的抗肿瘤疗法迫在眉睫。肿瘤免疫治疗是当下最热门的研究，其应用免疫学原理和方法，激活癌症患者的免疫系统，增强免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀伤，进而抑制肿瘤生长乃至消除肿瘤，是有望治愈癌症的方法。与传统疗法相比，肿瘤免疫治疗具有更高的疗效和安全性。<br>　　在免疫治疗中，特异性肿瘤作用靶点的选择显得尤为重要。癌-睾丸抗原(Cancer-testis antigen，CTA)是一类理想的肿瘤免疫作用靶点，该家族成员只表达于睾丸组织、胎盘的滋养层细胞和一些肿瘤组织，少量表达于卵巢中，而在其他正常组织不表达。SAGE1(Sarcoma antigen1)中文名为肉瘤抗原1，是CTA家族中的一员，研究发现其高表达于鳞状细胞癌中。SAGE1属于胞内抗原，抗体无法直接识别，但SAGE1可经MHC-Ⅰ(major histocompatibility complex-Ⅰ)类分子呈递其抗原肽形成MHC限制性SAGE1抗原肽复合物至细胞表面，而特异识别此类抗原肽复合物的抗体称为T细胞受体模拟抗体(T cell receptor mimic antibody，TCRm Ab)。TCRm抗体是一类可识别HLA-Ⅰ类限制性抗原肽复合物(peptide-human leukocyte antigen，pHLA)的抗体分子，其识别模式与TCR识别pHLA相类似。<br>　　本课题旨在筛选到靶向HLA-A*1101或HLA-A*2402限制性SAGE1抗原肽复合物的TCRm抗体，然后对筛选到的抗体进行亲和力优化，获得高亲和力的TCRm抗体。并以高亲和力的TCRm抗体为基础，制备抗CD3和抗SAGE1的双特异性抗体或是CAR(chimeric antigen receptor)分子，验证这两类效应分子是否能介导T细胞特异杀伤肿瘤细胞。<br>　　我们首先复性纯化了多种pHLA复合物，包括HLA-A*1101和HLA-A*2402限制性SAGE1抗原肽复合物(分别命名为MP047和MP010)用于筛选。使用本实验室构建好的Fab(Fragment of antigen binding)抗体库，利用噬菌体展示技术筛选特异抗体，筛选得到的抗体通过ELISA及分子相互作用仪检测验证抗体生化功能。我们从中筛选出一株特异结合MP047和一株特异结合MP010的TCRm抗体，分别命名为LG4和KF4，亲和力分别约为1.5×10-5M和1.9×10-5M。随后利用分子定向进化的方法对其进行亲和力优化，先在LG4和KF4的轻链和重链CDR3（complementary determining region3）区分别引入随机突变，构建了共四个突变文库(库容均超过109)，随后利用高通量的噬菌体展示技术，进行淘选。经过4-5轮的淘选，我们从LG4的轻链文库与重链文库中筛选到多株特异的且亲和力提高的突变体，并进行突变重链和突变轻链的随机组合，获得了亲和力有不同程度提高的抗体，其中亲和力最高的为LH6-HF9，与MP047的亲和力为2.59×10-9M，相较于野生型提高了近6000倍。然而，在KF4的突变文库中，筛选到两个突变体，但经过Fab的蛋白复性后检测发现，这些抗体与MP010无明显结合，因而终止后续KF4的实验。最后我们将包括LH6-HF9在内的多个高亲抗体，分别与抗CD3抗体融合，制备成双特异性抗体。复性后的双特异性抗体保持了对CD3和MP047的亲和力。另一方面，以高亲抗体为基础，构建出CAR分子。细胞实验表明，无论是几个双特异性抗体，抑或是CAR分子，都可以介导T细胞特异杀伤表达SAGE1阳性且为HLA-A*1101的黑色素瘤细胞SK-MEL-5，而不杀伤SAGE1+A*1101-的肝癌细胞SNU398或其它SAGE1A*1101+的各种肿瘤细胞。<br>　　该课题筛选获得的LG4及其高亲突变体，可用于杀伤表达SAGE1抗原的肿瘤细胞并有望用于治疗相关癌症。同时也为进一步筛选其它pHLA抗原的TCRm抗体奠定实验基础。