检索历史 清除

摘要肝脏和胰腺是人体两大重要外分泌腺，分泌食物消化所必需的消化液，这些消化液由充当管道系统的导管网络收集，分配到胆囊进行储存或消化道对食物进行消化加工。在胚胎发育过程中，肝脏、胆管及胰腺谱系的细胞均来源于共同的内胚层祖细胞。近年研究表明，在人的胆周腺中存在多能干细胞群，具有多向分化潜能，能分化为肝实质细胞、胆管细胞以及胰腺内分泌细胞;另有研究发现，在胰管腺中也存在功能类似的祖细胞。成体组织中的干/祖细胞制备的类器官是一种三维上皮结构培养物，已有研究证明，肝脏类器官具有向功能肝细胞分化的能力:小鼠胰腺类器官在移植到体内后可以分化为肝细胞和胰腺内分泌细胞。结合以上研究结果，我们推测肝胆胰导管上皮祖细胞具有相似的功能，都能向肝脏细胞、胆管细胞及胰腺内分泌细胞分化。因此本研究利用3D培养技术，分别建立小鼠的肝内胆管类器官(mouse hepatic duct organoid，mHDO)、胆总管类器官(mouse bile tree organoid，mBTO)和胰腺主导管类器官(mouse pancreatic duct organoid，mPDO)培养物，通过检测细胞分化能力、细胞谱系追踪和高通量转录组测序等方法验证肝胆胰上皮祖细胞的基因表达及功能的相似性:并成功建立了人胆管上皮类器官(human bile tree organoid，hBTO)，在体外利用3D培养，发现其可以向肝细胞，胆管细胞及胰腺β细胞分化，证明了hBTO向肝胆胰多谱系方向的分化潜能，为疾病治疗及药物筛选开辟了新途径，为器官损伤后的再生与与修复，特别是肝脏/胰岛移植发掘更广泛的细胞资源。<br>　　本研究的主要研究方法及结果:<br>　　1.利用机械法在解剖镜下直接分离获得肝内胆管(肝管)、胆总管及胰腺主导管(胰管)，通过胶原酶消化法获得肝胆胰导管上皮细胞，利用Matrigel作为基质，成功建立小鼠肝胆胰导管上皮祖细胞类器官细胞系mPDO、mBTO和mHDO，三种类器官具有连续的自我更新能力，经历冻存复苏后仍可连续传代至6个月以上。利用反转录PCR及免疫染色初步证明，三种类器官具有向多谱系分化的潜能。<br>　　2.分别制备三组肝胆胰导管类器官mPDO、mBTO和mHDO，利用转录组测序分析，比较三种类器官与组织中肝胆胰导管上皮细胞，及三种类器官之间的基因表达差异变化，结果证明与不同组织来源的导管细胞相比，培养后的三种类器官基因表达的差异变化及程度都显著降低，具有相似的基因表达水平。<br>　　3.利用Matrigel基质胶，结合特定的细胞培养条件，成功建立mPDO、mBTO和mHDO向肝实质样细胞(ALB表达细胞)、胆管细胞、胰腺β样细胞(Insulin分泌细胞)分化方法，利用体内移植及体外分化方法，证明三种类器官分化功能具有相似性。<br>　　4.利用细胞遗传谱系追踪方法，通过对转基因小鼠组织的连续切片观察，以及利用转基因小鼠制备mPDO、mBTO和mHDO，证明了肝胆胰导管上皮祖细胞均来源于PDXl表达细胞，尽管制备的三种类器官都广泛表达Lgr5，正常小鼠体内肝胆胰上皮细胞在胚胎发育、新生阶段及发育成熟后均无Lgr5的表达。<br>　　5.在证明了肝胆胰上皮祖细胞相似性的基础上，我们选取了最易获得的人胆管上皮组织建立人胆管类器官hBTO，并且建立了hBTO向肝实质样细胞(ALB表达细胞)、胆管细胞、胰腺β样细胞(Insulin分泌细胞)分化方法，为研究器官损伤后的再生与修复奠定基础。<br>　　结论:小鼠肝胆胰导管上皮细胞制备的类器官mPDO、mBTO和mHDO具有较高的相似性，包括具有相似的基因表达模式;具有向肝胆胰多谱系方向分化的潜能:具有相似的细胞谱系特征。进一步的，建立了人胆管类器官hBTO向肝胆胰分化的方法，为建立药物筛选模型、研究组织再生与修复以及器官移植开辟了新的途径。