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摘要1935年，黑龙江省克山县爆发了一场以急性或慢性心脏病为主要特征的地方性心肌病，引起了人们的高度重视，由于该病首次发生在克山县，因此命名为克山病。研究发现该病发生的地区处于硒缺乏地区，且中国土壤低硒带上都有本病的分布，还发现克山地区的食物都受到了单端孢霉烯类毒素和心肌病毒的感染。因此，硒的缺乏、单端孢霉烯类毒素的摄入和心肌病毒的感染都被认为是导致克山病发生的主要因素。<br>　　T-2毒素主要是由镰刀菌属代谢产生的A类单端孢霉烯族类霉菌毒素，由于T-2毒素的毒性强，稳定性好，并且是最常见的谷物污染物，因此受到了国际上的广泛关注，将其定为天然存在的最危险的食品污染源。T-2毒素对机体的多个器官和组织都能造成直接的危害，特别是分裂能力旺盛的细胞，比如胸腺、骨髓等。T-2毒素对心肌也有毒性作用，能引起心律失常，抑制心肌细胞的增殖，对心肌细胞造成氧化损伤。<br>　　硒是人体的必需微量元素，机体的基本生理过程都需要硒的参与，如甲状腺代谢等。缺硒会引起机体抗氧化能力下降、免疫能力降低、细胞蛋白质和DNA的合成出现异常，有研究证明给大鼠饲喂低硒饲料会造成心肌的损伤。<br>　　迄今为止，硒和T-2毒素之间的关系和作用机理仍不是很清楚。本试验以1-3天Wistar大鼠原代心肌细胞无血清培养作为试验模型，主要是探讨T-2毒素对心肌细胞损伤的影响，低硒对T-2毒素诱发的心肌细胞损伤的影响，并从自噬的角度探讨机制，以期为克山病的发病机制的阐明提供依据。具体研究内容如下:<br>　　试验一:T-2毒素对心肌细胞的毒性及其自噬机理研究<br>　　当80%以上的原代心肌细胞发生统一的节律性跳动时，用不同浓度的T-2毒素(0，0.125，0.25，0.5，1μM)处理心肌细胞24h，用MTT和LDH试剂盒分别测定心肌细胞的活力和细胞损伤情况、Westem Blot测定cleaved-caspase3蛋白浓度、Hoechst33258染色观察细胞数。由实验结果可知，0.25μM的T-2毒素能够显著地降低细胞活力，同时，显著地增加了心肌细胞的损伤程度和细胞凋亡标志蛋白cleaved-caspase3的表达量，并呈剂量依赖性。镜下观察发现，与未用T-2毒素处理的心肌细胞组相比，0.25μM的T-2毒素处理心肌细胞后，心肌细胞数量明显地减少（约减少25%），且细胞核发生固缩。该结果表明T-2毒素能够抑制心肌细胞的活性，诱导心肌细胞发生损伤，并且促进心肌细胞发生凋亡。为了探讨T-2毒素对心肌细胞自噬的影响，用不同浓度T-2毒素处理心肌细胞24h后，分别用Westem Blot、Real-time PCR的方法检测细胞中自噬蛋白LC3和自噬基因Beclin-1的表达量，发现0.25μM的T-2毒素处理心肌细胞后，能够显著地促进心肌细胞内LC3-Ⅱ和Beclin-Ⅰ的表达(P＜0.05)．该结果表明T2毒素能够促进心肌细胞发生自噬;为了进一步探讨细胞自噬在T-2毒素诱导的心肌损伤中的作用，分别设立雷帕霉素(Rapamycin)对照组和3．甲基腺嘌呤(3-MA)对照组，先分别用自噬诱导剂Rapa和自噬抑制剂3-MA处理心肌细胞2h，然后再用0.25μM的T-2毒素处理心肌细胞24h，测定心肌细胞活力和cleaved-caspase3蛋白的表达量，发现促进细胞自噬会降低心肌细胞cleaved-caspase3的表达，并且增加了心肌细胞活力，然而，抑制细胞自噬后会增加细胞cleaved-caspase3蛋白的表达，降低细胞的活力，这表明自噬在T-2毒素诱导的心肌细胞损伤中起了保护的作用。<br>　　试验二:低硒对T-2毒素诱导的心肌细胞损伤的影响及其自噬机理研究<br>　　用无血清培养基培养原代心肌细胞24h，营造一个心肌细胞缺硒的环境，然后换成含不同浓度硒蛋氨酸(SeMet)(0，0.5，1，2μM)的DMEM培养基培养12h后，加入0.25μM的T-2毒素继续培养24h，分别测定心肌细胞的活力、心肌细胞损伤情况以及cleaved-caspase3蛋白表达量。发现，随着细胞缺硒情况的加剧，心肌细胞活力不断下降，且细胞损伤情况不断加剧，cleaved-caspase3蛋白表达量增加，这表明低硒能够加剧T-2毒素诱导的心肌细胞的损伤;为了探究低硒加剧T-2毒素诱导的心肌细胞损伤与细胞自噬之间的关系，用含不同浓度SeMet的无血清细胞培养液预敷12h后，加入0.25μM的T-2毒素，分别用Westem Blot、Real-time PCR的方法检测细胞中自噬相关蛋白LC3和自噬相关基因Beclin-1的含量，发现与硒充足组相比，低硒处理组心肌细胞内LC3-Ⅱ蛋白和Beclin-1mRNA水平均下降，并且伴随着低硒程度的加剧，LC3-Ⅱ与Beclin-1的表达量也不断下降。这表明低硒通过抑制心肌细胞的自噬从而加剧了T-2毒素诱导的心肌细胞的损伤。<br>　　本论文研究结果显示，低硒条件下，T-2毒素诱导原代大鼠心肌细胞发生更加严重的损伤。并且，低硒通过抑制心肌细胞自噬来增强T-2毒素的毒性作用。这项研究从自噬的角度进行阐述，有助于进一步揭示低硒与T-2毒素的相互作用机制，以期为克山病的机理研究提供重要意义。