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摘要目的:<br>　　沙门菌作为一种肠道致病菌，可因人或动物食用不洁的水或食物引起感染，严重者甚至致死。在大多数致病性沙门菌中，均含有一段沙门菌质粒毒力基因（Salmonella plasmid virulence，spv）序列，其中spvB所编码的蛋白在细菌致病过程中发挥重要作用。中性粒细胞作为外周血白细胞中最多且最早到达感染部位的细胞，发挥吞噬清除、释放细胞因子和形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular trap，NET)等功能。NETs是一种由中性粒细胞释放的以DNA为基本骨架、上面缠绕有多种蛋白酶的网状结构。为探究沙门菌感染时沙门菌质粒毒力基因spvB与中性粒细胞NETs在抗感染免疫中的相互作用，本研究第一部分用携带spvB基因的鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium，STM）标准株野生型SL1344和spvB基因敲除突变株SL1344-AspvB，感染仅有固有免疫的斑马鱼幼鱼，观察spvB对斑马鱼幼鱼体内胞外诱捕网（extracellualr trap，ET）和NETs生成的影响;第二部分用SL1344，SL1344-AspvB和spvB基因回补株SL1344-c-spvB与中性粒细胞共培养，用细胞模型探究spvB对中性粒细胞NETs生成的影响及其分子机制，为阐明沙门菌质粒毒力基因spvB的致病机制及中性粒细胞在抗感染免疫中的作用提供理论和实验依据。<br>　　方法:<br>　　一、观察spvB对斑马鱼幼鱼ETs和NETs生成的影响<br>　　1.spvB对斑马鱼幼鱼ETs生成的影响<br>　　109CFU/ml SL1344和SL1344-AspvB浸染法感染受精后5d(dayspost fertilization，dpf)的斑马鱼幼鱼，于感染后6h、8h和10h收样，用蛋白质印迹法(Western Blot)检测斑马鱼幼鱼体内ETs相关蛋白瓜氨酸化组蛋白3(citrullinated histone3，CitH3)和肽基精氨酸脱氨酶-4（peptidyl arginine deiminase-4，PAD4）的表达水平。<br>　　2.红色荧光菌的构建<br>　　用电转化法将表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)的质粒分别转入SL1344和SL1344-AspvB中，在含氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）的平板进行筛选，所得菌株在荧光显微镜下观察并用聚合酶链式反应(ploymerase chain reaction，PCR)进行扩增验证。<br>　　3.spvB对斑马鱼幼鱼NETs生成的影响<br>　　109CFU/ml表达RFP的RFP-SL1344和RFP-SL1344-AspvB浸染法感染中性粒细胞表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的5dpf转基因斑马鱼Tg(lyz:GFP)，在收集标本前30min加入SYTOX Blue核酸荧光染料，于感染后8h收集斑马鱼幼鱼，用细胞成像仪观察斑马鱼幼鱼体内NETs生成情况。<br>　　二、spvB对中性粒细胞NETs生成的影响及其分子机制<br>　　1.中性粒细胞感染模型的构建<br>　　在稳定增殖的人早幼粒细胞HL-60细胞培养基中加入1.25％二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，分别于诱导后6d、7d和8d用流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测诱导分化细胞(differentiated HL-60，dHL-60)上CDl1b的表达，并用瑞氏.姬姆萨法染色后在光镜下观察细胞形态。<br>　　将SL1344分别以感染复数（multiplicity of infection，MOI）5∶1、10∶1和20∶1与dHL-60共培养4h，甲醛固定后瑞氏-姬姆萨法染色光镜下观察细胞形态。根据实验结果，将SL1344以MOI10∶1与dHL-60共培养1h、2h、4h、6h和8h后收集细胞，Western Blot检测NETs相关蛋白CitH3的表达。<br>　　2.spvB对中性粒细胞NETs生成的影响<br>　　用SL1344、SL1344-AspvB和SL1344-c-spvB以MOI10∶1与dHL-60共培养2h，分别加入70U/ml脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNase)处理15min，用SYTOX Green核酸荧光染料染色后在荧光显微镜下观察胞外DNA结构的生成情况。<br>　　上述菌株以MOI10∶1与dHL-60共培养1h、2h和4h后收集细胞和上清，Western Blot检测NETs相关蛋白髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、CitH3和PAD4的表达水平;Picogreen dsDNA定量法检测上清中双链DNA(double-strand DNA,dsDNA)含量。<br>　　结果:<br>　　一、观察spvB对斑马鱼幼鱼ETs和NETs生成的影响<br>　　1.spvB对斑马鱼幼鱼ETs生成的影响<br>　　109CFU/ml SL1344和SL1344-AspvB浸染法感染5dpf斑马鱼幼鱼，Western Blot检测ETs相关蛋白CitH3和PAD4的表达水平。结果显示在感染后6h、8h和10h，SL1344-AspvB感染组CitH3表达水平高于SL1344感染组（P＜0.05）;在感染后6h和8h，SL1344-AspvB感染组PAD4表达水平高于SL1344感染组（P＜0.05)，在感染后10h，两感染组间PAD4的表达水平无统计学差异。以上结果说明spvB能抑制斑马鱼幼鱼ETs的生成。<br>　　2.红色荧光菌的构建<br>　　将表达RFP的质粒用电转化法导入SL1344和SLI344-AspvB后，在含Amp的平板筛选出菌落，所得菌落在荧光显微镜下观察发红色荧光;对spvB、spvC和rfp基因片段用PCR进行验证，结果显示RFP-SL1344含有spvB基因片段，RFP-SL1344-AspvB没有spvB基因片段，RFP-SL1344和RFP-SL1344-AspvB均含有spvC和rfp基因片段。<br>　　二、spvB对中性粒细胞NETs生成的影响及其分子机制<br>　　1.中性粒细胞感染模型的构建HL-60细胞经1.25％DMSO诱导分化6d、7d和8d后，FCM检测细胞上CDl1b的表达结果显示，诱导后7d时细胞上CDl1b表达量最高，达80％以上，且此时瑞氏.姬姆萨法染色可见细胞呈典型中性粒细胞形态，可用于后续实验。<br>　　将SL1344与dHL-60以MOI5∶1、10∶1和20∶1共培养4h后，瑞氏-姬姆萨法染色结果显示，各组细胞均有细菌进入，MOI为5∶1时细胞形态完整，与未感染组无显著差异;10∶1时仅有极少数细胞出现胞质松散现象;20∶1时部分细胞出现明显破坏。综合以上结果，以MOI10∶1作为适宜比例用于后续实验。将SL1344以MOI10∶1与dHL-60共培养1h、2h、4h、6h和8h后，Western Blot检测结果显示，各时间点SL1344感染组CitH3的表达水平高于未感染组（P＜0.05）;感染4h后的各时间点之间差异不显著，故后续实验选择检测时间为感染后1h、2h和4h。<br>　　2.spvB对中性粒细胞NETs生成的影响<br>　　将SL1344、SL1344-AspvB和SL1344-c-spvB以MOI10∶1与dHL-60共培养2h，用70U/ml DNase处理后SYTOX Green核酸荧光染料染色。荧光显微镜下显示，DNase未处理时SL1344-AspvB感染组胞外DNA网状结构显著多于SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组;DNase处理后三个感染组的胞外DNA结构均消失。<br>　　上述菌株以MOI10∶1与dHL-60共培养1h、2h和4h后，Western Blot检测NETs相关蛋白MPO、CitH3和PAD4的表达。结果显示，感染后1h、2h和4h，SL1344-AspvB感染组MPO、CitH3和PAD4的表达水平均高于SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组(P＜0.05);Picogreen dsDNA定量法检测上清dsDNA结果显示，感染后1h和2h，SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组的上清中dsDNA均低于SL1344-AspvB感染组（P＜0.05），感染后4h三感染组间上清中dsDNA的含量无统计学差异。以上结果说明spvB能够抑制中性粒细胞NETs的生成。<br>　　3.spvB影响中性粒细胞NETs生成的分子机制<br>　　将SL1344、SL1344-AspvB和SL1344-c-spvB以MOI10∶1与dHL-60共培养1h、2h和4h后，Western Blot检测p-PKC表达水平。<br>　　结论:<br>　　1.在斑马鱼幼鱼体内，沙门菌质粒毒力基因spvB可抑制ETs和NETs的生成。<br>　　2.在中性粒细胞感染模型中，沙门菌质粒毒力基因spvB可抑制中性粒细胞NETs的生成。<br>　　3.沙门菌质粒毒力基因spvB可通过抑制PKC的活化，下调PAD4的表达从而抑制中性粒细胞NETs的生成。