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摘要本论文由RNA适配体(Ribonucleic acid aptamer)的体内筛选及其与抗生素结合产生类抗性作用的研究组成。RNA适配体是一类能够与靶标分子特异性结合的功能性RNA，是由哈佛大学的Jack Szostak教授、美国Scripps研究所的Gerald Joyce教授以及科罗拉多大学的Larry Gold教授3个不同的课题组在同一时期报道。RNA适配体通过折叠形成多种二级结构和三级结构，比如茎(Stem)、环(Loop)、发夹(Hairpin)、三聚体(tripolymer)和四聚体(Quadruplex)等，通过疏水、氢键、静电等作用与小分子化合物、金属离子、蛋白质和细胞等靶标分子结合形成特殊的三维结构而具有较高的特异性和亲和力。RNA适配体现已经成为一个全新的分子工具，在生物分析、医学诊断等基本需求以及新兴发展的纳米技术、基因治疗等应用方面发挥着越来越大的作用，相关的研究工作近年来也不断增加。目前报道的绝大部分RNA适配体是通过体外筛选(SELEX or in vitro selection，指数富集的配体系统进化技术)筛选获得。<br>　　本论文的研究内容是基于功能化RNA适配体的优势，结合实验室前期建立的RNA适配体的体内筛选策略，进行RNA适配体的体内筛选，以期达到相关靶标分子的检测;探索RNA适配体在体内的抗性作用，从而验证其作为类抗性基因应用的可行性。具体分为:<br>　　1.基于功能性RNA适配体Spinach非保守部分的结构转换引起荧光信号变化，在体内筛选L-别异亮氨酸的RNA适配体。利用Spinach功能性RNA适配体的基本骨架，将DNA核酸文库构建到质粒中，构建了包含5×107大小的核酸文库，并进行了FACS的分选，拟开发一种基于全细胞荧光变化的RNA适配体，实现对L-别异亮氨酸的检测。此外，另一部分内容是基于毒蛋白ibsC筛选平台进行RNA适配体的筛选。我们在锤头型核酶的StemⅢ和LoopⅢ结构上，构建氨基酸的随机核酸文库，通过在筛选平板上添加相应氨基酸，在其下游调节ibsC毒蛋白的表达，从而最终筛选其RNA适配体。首先在大肠杆菌体内利用L-精氨酸的RNA适配体进行筛选方法的可行性验证，随后筛选了L-别异亮氨酸的RNA适配体，但目前还不能确定筛选得到的RNA适配体的效果。<br>　　2.RNA适配体作为类抗性基因的可行性探究。<br>　　抗性基因(Resistance genes)是一种选择标记基因，通过翻译成蛋白酶对抗生素进行修饰而起作用，常用于目的菌株的培养、挑选和鉴定。某些重要的功能生物分子如Ⅰ型内含子、核酶与抗生素结合也有重要作用。自从适配体发展以来，例如卡那霉素(Kanamycin)、妥布霉素(Tobramycin)、新霉素(Neomycin)等多种抗生素的RNA适配体被报道。马里兰大学的Green教授关于小分子与RNA适配体结合调节基因表达的报道中显示，抗生素和RNA适配体结合可使大肠杆菌存活。基于此，本文第二部分提出了抗生素的RNA适配体作为类抗性基因的体内应用的可行性。以新霉素B及其RNA适配体为例，建立利用tRNA支架稳定并富集RNA适配体的策略，使之能够在体内稳定存在，发挥类似抗性基因的功能，产生耐受新霉素B的抗性作用的能力。结果显示新霉素B的RNA适配体能够产生耐受新霉素B的抗性能力，得到两个RNA适配体A site和Avirus具有最高的耐受新霉素B的能力，在固体培养基上的耐受浓度为19μg/ml、在液体培养基中的耐受浓度为30μg/ml。在体内验证筛选新霉素B的RNA适配体，表明含有RNA适配体的大肠杆菌具有耐受新霉素B的能力，具有作为抗性基因的潜在可能性。该策略有望用于抗性基因的优化，用于缩小质粒载体载量，为分子生物学研究提供新的手段。