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摘要中药与天然药物中含有多种有效成分，它们通常共同发挥药效作用。中药与天然药物中的多成分、多靶点之间的协同作用特点是中药药理机制研究中的重要层面。中药成分多样可契合生物多靶，而生物靶标之间的协同作用是中药起效机制的重要补充。一些多成分、多靶点药物对于复杂疾病起到了很好的治疗效果，是对经典的“一药一靶”药物发现理念的有效补充。<br>　　尽管及时和完全再灌注是减少梗死面积和抑制随后心室重构的最有效方法，但再灌注本身额外增加了心肌和冠状动脉循环的不可逆损伤，即心肌缺血/再灌注损伤(MIRI)，并加大最终的梗死面积。在建立心外膜梗死相关动脉的通畅性的同时，增加额外的心脏保护策略以减少梗死面积和冠状动脉微血管功能障碍，这是再灌注治疗的“最后壁垒”。天然药物DM具有补益心脑、活血化瘀、通络开窍、止痛解毒、利尿止咳等多种功效，其用于治疗冠心病及血液质旺盛（高血压）已有几百年的实践史，疗效确切、显著。DM针对冠心病、心绞痛等综合症状，可显著改善心肌缺血状况。而且，课题组前期已经发现天然药物DM的有效物质群为DM4、DM6和DM9，通过在体心脏模型发现DM粗提物效果优于单体化合物，并应用心肌细胞模型证实有效物质群效果优于单体且筛选得到最佳配伍比例。基于上述结果，我们提出假设，应用“多成分、多靶点”药物可以对抗MIRI。<br>　　基于以上假设，首先本研究拟建立一种新型的斑马鱼幼鱼的缺氧/复氧模型，然后应用此模型从整体动物水平上筛选DM有效物质群的最佳配伍比例。同时，比较有效物质联合及单独使用在不同细胞中的吸收情况和对斑马鱼幼鱼心血管毒性的大小，分别从协同促药效、促吸收、降毒性三个方面尝试探究其联合使用的作用机制。最后本课题拟考察DM的最佳配伍比例的工艺可实现性。<br>　　本研究分别应用间歇和持续缺氧法建立了斑马鱼幼鱼缺氧/复氧模型。①造模后幼鱼的心脏面积缩小率显著降低，显示心脏收缩功能紊乱;模型组的心肌肌钙蛋白(tnnt)，心钠肽(nppa)，脑钠肽(nppb)的基因表达水平显著高于对照组，揭示幼鱼心肌损伤和心衰的发生。给予异丙肾上腺素治疗能有效恢复幼鱼心功能并降低tnnt的基因表达水平。②造模后幼鱼肠道中性粒细胞数量、肿瘤坏死因子(tnfα)和白介素（il1β)的基因表达水平显著高于对照组。美沙拉秦和阿司匹林能有效减少中性粒细胞的数量从而降低炎症反应，并能显著降低tnfα的表达，而阿司匹林能显著降低il1β的表达。③DCFH-DA染色结果显示模型组幼鱼活性氧含量显著高于缺氧组，超氧化物歧化酶（sod2）基因表达显著增加。维生素E和维生素C能较好降低活性氧含量和sod2的基因表达。④模型组幼鱼静脉淤血程度显著加重，伊那普利和美托洛尔能显著减轻静脉淤血。⑤模型组幼鱼心脏红细胞数量显著增加，促红细胞生成素受体(epor)基因的表达显著升高。华法林和阿司匹林能有效减少红细胞数量。<br>　　接下来应用斑马鱼模型筛选了3种有效成分的最佳配伍比例。采用D-最优设计方法设计了DM4、DM6和DM9的11种配伍比例，在斑马鱼模型上，针对5个指标进行药效评价，结果经数学模型拟合后得到3D曲面图并获得最佳配伍比例为DM4∶DM6∶DM9=1.7∶1∶3.3;结果显示配伍组药效优于单体，配伍组H、M、L的作用效应逐渐减弱，与数学模型预测趋势一致;且配伍组H药效优于课题组前期通过心肌细胞模型筛选得到的最佳配伍比例(DM4∶DM6∶DM9=1.7∶3.1∶1.2)。<br>　　4种细胞对DM有效物质群的吸收结果显示，3种化合物不仅能被与MIRI相关的心肌、血管内皮和嗜碱性粒细胞吸收，也能被黑色素瘤细胞吸收。DM6在心肌细胞和血管内皮细胞中的吸收远远高于碱性粒细胞和黑色素瘤细胞。联合给药大大降低DM6在心肌、内皮细胞中的吸收，提示联合给药无促吸收效果。<br>　　以斑马鱼幼鱼对配伍组和单体的心血管毒性进行初步考察，发现:单体DM6、DM4和DM9对斑马鱼胚胎毒性依次降低，而配伍组由于能促进DM6的水溶性而增加毒性，导致幼鱼死亡率增加。配伍组导致幼鱼体长显著降低，静脉窦-动脉球距离延长，提示配伍组较单体毒性增加。<br>　　本研究还对DM的最佳配伍比例的工艺可实现性进行了初步研究，经优化乙醇提取工艺和大孔树脂纯化工艺参数得到DM纯化产物。纯化产物中DM4、DM6和DM9的摩尔浓度比为3.11∶0.46∶2.43，与模型筛选得到的最佳配伍比例有较大的差别。后期需使用适量添加单体化合物的方法调整比例或者进一步改进工艺。<br>　　本研究成功建立了一种全新的斑马鱼幼鱼缺氧/复氧模型，该模型可作为哺乳动物模型的一种补充用于高通量筛选抗MIRI药物。应用这一模型筛选得到DM有效物质群的最佳配伍比例，并证明其药效作用优于细胞模型筛选的配伍比例。3种化合物在心肌、血管内皮、嗜碱性粒细胞和黑色素瘤细胞中均有不同程度的吸收，联合给药无促吸收效果。联合给药会增加毒性。经优化的DM提取纯化工艺能提高有效组分的含量，但与最佳配伍比例有一定差距。本课题为开发抗MIRI的多靶点联合治疗药物提供了数据支持，并在探讨中药多成分协同起效机制方面进行了一些尝试。