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摘要研究目的:<br>　　2型糖尿病是世界上主要的慢性疾病之一。肝脏糖异生是空腹时维持机体糖稳态的重要途径，抑制过度增加的肝脏糖异生是改善高血糖的有效手段之一。盐诱导激酶1(Salt induced kinase1，SIK1)在许多生理过程中起关键调节作用。然而，关于SIK1调节肝脏糖异生功能的报道很少，其对肝糖异生的调节功能和潜在的作用机制尚未完全阐明。我们研究发现，天然活性产物phanginin A可以激活SIK1并进一步抑制糖异生。本论文将以phangininA作为小分子探针，研究并阐明phanginin A通过SIK1调控肝细胞糖脂代谢的分子机制，并评价phanginin A的体内抗糖尿病药效，为开发糖尿病活性先导化合物提供实验依据和理论基础。<br>　　实验方法:<br>　　采用小鼠原代肝细胞研究phanginin A在基础水平和forskolin或胰高血糖素诱导条件下对糖异生的作用，并检测关键基因磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate Carboxykinase，PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-hophsphatase，G6P)mRNA的表达。采用ELISA试剂盒检测phanginin A对小鼠原代肝细胞环磷腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)含量及蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)活性的影响。运用免疫印迹法检测环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)和SIK1的磷酸化水平。采用SIK广谱抑制剂和siRNA介导的敲低来阐明SIK1激活与phanginin A抑制糖异生的相关性。采用磷酸二酯酶(Phosphodiesterases，PDE)试剂盒测定phanginin A对总PDE和PDE4活性的影响，并探索phanginin A抑制cAMP/CREB信号通路与SIK1-PDE4的关系。采用肝脏激酶B1(liver kinase B1，LKB1)siRNA介导的敲低探索phanginin A激活SIK1与LKB1之间的相关性。采用SIK1表达质粒进一步验证SIK1过表达后对糖异生及PDE4-cAMP通路的作用。评价phanginin A单次口服给药对C57BL/6J和2型糖尿病ob/ob小鼠丙酮酸耐量的作用;评价phanginin A单次和长期口服给药后对2型糖尿病ob/ob小鼠的治疗作用。观察phanginin A单次和长期给药后对ob/ob小鼠肝脏SIK1、CREB磷酸化的作用，并检测cAMP含量及PDE4活性以及糖异生过程关键基因的表达。研究phanginin A对HepG2细胞脂质合成的影响及其作用机制。<br>　　实验结果:<br>　　Phanginin A能够显著抑制小鼠原代肝细胞糖异生，降低细胞PEPCK和G6P的基因表达，同时抑制cAMP信号通路。Phanginin A可显著增加小鼠原代肝细胞SIK1的磷酸化，激活PDE4并进而抑制cAMP/PKA通路。抑制SIK1的活性或干扰SIK1表达可完全逆转phanginin A对PDE4活性、cAMP信号通路以及糖异生的作用，且PDE4抑制剂Roflumilast也可阻断phanginin A对cAMP和糖异生的抑制作用。Phanginin A激活肝细胞内SIK1及抑制糖异生作用依赖于LKB1。小鼠原代肝细胞中SIK1过表达也可抑制cAMP通路和糖异生。体内实验结果表明，phanginin A单次给药可增加2型糖尿病ob/ob小鼠肝脏SIK1磷酸化，增加PDE4活性并降低cAMP的含量，最终抑制CREB磷酸化。Phanginin A单次给药能够改善2型糖尿病ob/ob小鼠和C57BL/6J小鼠的丙酮酸耐量，对ob/ob小鼠单次给药具有急降血糖作用，长期给药能够改善ob/ob小鼠的高血糖症状，改善口服糖耐量，并能有效降低血脂和肝脂。Phanginin A可激活HepG2细胞SIK1并有效抑制甘油三酯合成，相关基因的mRNA水平也相应降低。<br>　　研究结论:<br>　　本论文首次发现天然活性产物Phanginin A可通过增加SIK1磷酸化间接激活PDE4，抑制cAMP/PKA/CREB信号通路，进而抑制肝糖异生。Phanginin A单次和长期给药均可降低ob/ob小鼠的血糖，且长期给药可改善机体脂代谢紊乱。本论文以phanginin A为小分子探针，揭示了肝脏SIK1通过PDE4-cAMP轴调控糖异生的作用机制，也为以phanginin A作为治疗2型糖尿病的先导化合物提供了实验基础和理论依据。