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摘要糖基水解酶18家族(GH18)几丁质酶(chitinase，EC3.2.1.14)水解几丁质和几丁寡糖中的β-1，4糖苷键。GH18几丁质酶广泛分布于细菌、真菌、线虫、植物、节肢动物和哺乳动物中，参与细菌营养、真菌细胞壁重塑、线虫发育、节肢动物蜕皮、植物和哺乳动物免疫防御等过程。<br>　　几丁质是昆虫外骨骼、气管和围食膜的主要结构组分。昆虫蜕皮相关的GH18几丁质酶的RNA干扰导致了昆虫蜕皮异常和死亡，说明几丁质酶对昆虫蜕皮和发育过程至关重要。因此，GH18几丁质酶是开发药物和农药的潜在靶点。<br>　　人类表达两种GH18家族几丁质酶，即壳三糖酶(Chit1)和酸性哺乳动物几丁质酶(AMCase)，抵抗含几丁质的病原菌或寄生虫的入侵。尽管Chit1被发现参与了肺部纤维化和致病性2型炎症反应，但是其确切的功能仍然存在部分未知。开发高活性、高选择性和具有体内活性的Chit1抑制剂对于研究其功能具有重要意义。<br>　　本论文以农业害虫亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）来源的OfChtI和OfChi-h，以及人类来源的HsChit1作为靶点开发新型几丁质酶抑制剂。对抑制剂的结合模式、选择性机理和生物活性进行了研究。主要取得以下成果:<br>　　1)开发新型OfChtI特异性抑制剂骨架<br>　　通过2轮基于OfChtI的晶体结构的虚拟筛选，从商品化化合物数据库中鉴定到17个化合物。这些化合物中，来自FQ系列（呋喃并喹啉骨架）的3个化合物对Of ChtI的半数抑制浓度达到微摩尔级别。来自TP系列（噻吩并萘啶骨架）的1个化合物对OfChtI以及细菌、真菌和人类几丁质酶均具有抑制活性。分子对接结果显示，FQ系列化合物结合在OfChtI底物结合裂缝的非还原端，分别与Glu148和Trp34形成氢键相互作用和堆积作用。<br>　　(2)OfChi-h的抑制剂筛选及抑制机理<br>　　大部分农业害虫均属于鳞翅目昆虫。开发鳞翅目特有的Chi-h几丁质酶抑制剂有助于解决杀虫剂对益虫的毒性问题。以OfChi-h为靶点进行虚拟筛选，获得了具有联吡啶并嘧啶骨架结构的2-8系列和2-8-s系列化合物。化合物2-8-s2对OfChi-h具有最高的抑制活性，抑制常数为9nM。通过解析2-8-s2与OfChi-h复合物晶体结构，发现抑制剂联吡啶并嘧啶骨架与+1位Trp268和+2位Trp389形成堆积作用，3位取代基的吡啶环氮原子和酰胺键氮原子与催化氨基酸Glu308和活性位点保守的Asp384分别形成氢键相互作用。此外，2-8-s2的1位呋喃环的氧原子与OfChi-h的Arg439形成氢键相互作用。通过等温滴定量热法测定了2-8-s2与几丁质酶结合的热力学变化，2-8-s2与OfChi-h结合的焓变|△H|大于HsChit1和SmChiB的焓变，说明了氢键相互作用是产生选择性的原因。<br>　　(3)HsChit1抑制剂及抑制机理<br>　　测定2-8和2-8-s系列化合物对HsChit1的抑制活性，发现2-8-14具有最强的抑制活性，其Ki值为49nM。化合物2-8-14与HsChit1的复合物晶体结构显示，2-8-14与+1位Trp99和+2位Trp218形成堆积作用，与活性位点的Glu140，Glu297，Asp213和Arg269形成水分子介导的氢键相互作用。在博来霉素诱导的小鼠肺部纤维化模型中，2-8-14抑制了60％肺部组织几丁质酶活性，导致炎症相关细胞数目的增加，说明Chit1对维持早期纤维化的肺部免疫稳态具有保护作用。<br>　　综上，通过虚拟筛选以及体外和体内实验，获得了对昆虫和人类几丁质酶具有较高抑制活性和选择性的抑制剂。结合结构生物学和计算模型揭示了抑制剂的结合模式和选择性机理。发现的新型几丁质酶抑制剂骨架结构为绿色农药以及小分子工具和炎症调节药物的开发提供了新的起点。