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摘要病毒是海洋中丰度最高的一种生命有机体，其中大多数为噬菌体。在海洋中，由噬菌体感染造成的细菌死亡率可高达50-80％，它们在调控海洋微生物群落结构与功能以及驱动海洋生物地球化学循环方面担当重要的角色。海洋中噬菌体无时无刻不在感染着细菌，与此同时，细菌也会产生各种抵抗噬菌体感染的能力来维系自身的生存，二者之间的“军备竞赛”不仅会影响它们的生物进化，并可能影响它们驱动的生态过程。然而以往对海洋细菌-噬菌体的互作关系研究主要集中在海洋噬菌体多样性以及噬菌体感染对海洋微生物的致死率和群落结构影响等内容上，而忽略了海洋细菌易对噬菌体的感染产生抗性这一重要方面，而这一定程度上可削弱海洋中噬菌体对微生物的致死率，所以无论是在海洋微生物进化层面，还是海洋生态层面，都是不可忽略的重要内容。针对以上不足，该论文选择以一种重要海洋细菌功能类群-玫瑰杆菌的模式株Roseobacter denitrificans OCh114为代表，研究了其在3株不同噬菌体感染胁迫下的抗性突变，通过对获得的30株抗噬菌体突变株进行比较基因组分析，解析了宿主菌基因突变的特征;进而通过基因敲除和回补等方法深入研究了其抗噬菌体感染的分子机制，并通过多组学技术分析了宿主菌获得抗性突变后自身代谢的变化（或trade-off效应）。此外，该论文同时关注了海洋噬菌体在病原菌防控方面的应用开发，因细菌对噬菌体易于产生抗性突变是限制噬菌体应用的一个重要瓶颈，在前面研究基础上，以海洋条件致病菌-弧菌为例，探索了如何通过不同噬菌体搭配来避免宿主菌产生抗性突变的策略，并获得一种可高效清除溶藻弧菌致病菌的噬菌体组合。本论文主要研究结果如下:<br>　　1、R.denitrificans OCh114抵抗噬菌体感染的突变特征。实验发现R.denitrificans OCh114容易对3种不同噬菌体的感染产生抗性突变，而且其突变率与噬菌体的感染浓度有一定关系。通过对获得的30株不同抗性突变菌株进行基因组重测序，发现30株抗性突变株的基因组中共有6种不同的基因发生突变。即使同一噬菌体感染胁迫下宿主菌的基因突变也各具不同，表明噬菌体感染不仅容易诱发细菌产生抗性突变，并可促进细菌的多样性进化。然而，宿主菌中6种不同基因的突变概率存在明显差异，其中以糖基转移酶基因的突变概率最高。进而对6种突变基因的抗性策略进行初步分析发现它们均是通过吸附抑制阻断了噬菌体的感染过程。<br>　　2、R.denitrificans OCh114突变株抵抗噬菌体感染的分子机制。在实验室成功构建了OCh114的基因敲除和回补体系，重点对OCh114基因组中突变概率最高的糖基转移酶基因开展了深入研究，探索了糖基转移酶基因敲除和回补前后宿主菌OCh114对噬菌体感染的抗性变化。结果表明敲除糖基转移酶基因后的宿主菌对噬菌体感染产生了抵抗，而对敲除株进行基因回补后宿主菌又重新获得了对噬菌体感染的敏感性，证实了糖基转移酶基因是宿主菌获得抗噬菌体能力的关键基因。另外，研究发现细菌表面的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是噬菌体感染的吸附位点，由此我们推测糖基转移酶基因的突变可能导致细胞表面的LPS结构发生了改变，从而导致噬菌体无法正常吸附，中断了正常的感染过程。<br>　　3、R.denitrificans OCh114抗噬菌体突变对自身代谢的trade-off效应。通过对相同培养条件下OCh114野生型菌株和抗噬菌体突变菌株（糖基转移酶基因突变）的转录组、蛋白质组和代谢组的比较分析，揭示了宿主菌在获得抗噬菌体能力的同时，自身代谢通路产生了很多变化。其中，突变株中参与LPS合成代谢的一些关键基因、蛋白或中间代谢产物变化明显。例如，在转录组层面，4个参与O-抗原转运的ABC transporter和1个脂质A合成基因lpxD的转录水平均显著下调;在蛋白质组层面，1个参与糖转移的ABC transporter的表达水平显著下调;同时在代谢组层面1个O-抗原合成前体UDP-N-acetylmuraminate的量显著减少。这些变化进一步证实糖基转移酶基因的突变可能是致使突变株表面的噬菌体吸附受体LPS发生改变，进而抑制噬菌体感染的主要原因。此外，获得抗性突变后，OCh114中一些初级代谢产物合成相关途径如糖酵解途径、磷酸戊糖途径、氨基酸代谢途径以及嘌呤和嘧啶代谢途径也受到显著影响。同时，参与多药耐药代谢、光合代谢和硫代谢的相关通路也产生了不同程度的变化。研究结果提示在噬菌体和细菌的长期战斗中，虽然一部分细菌通过基因突变，可获得抵抗噬菌体感染的能力并生存下来，但其自身代谢特征或生存能力也会产生明显改变，进而促进宿主微生物代谢功能的多样性变化，并可能影响其参与的海洋生地化循环过程。<br>　　4、一株海洋噬菌体的分离鉴定与其应用潜力评价。分离获得一株可感染条件致病弧菌-坎氏弧菌（Vibrio campbellii）的海洋噬菌体vB_VcaS_HC，对其进行了全面鉴定。该噬菌体裂解能力较强，5.5h内即可使细菌的致死率达到96％。其双链环形DNA基因组大小为81，566bp，共包含121个ORF，其中约70％是未知功能的ORF。该噬菌体基因组中除了包含常见的与噬菌体结构组装和核酸代谢相关的基因外，还包含10个辅助代谢功能基因，其中丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)基因是首次在噬菌体基因组中被发现，其编码的PPDK是糖酵解途径(EMP)的关键酶。另外，该噬菌体虽然表现出较强的裂解能力，然而其基因组中却存在一个溶源途径相关的重组酶RecA基因，但实验中并没有观察到该噬菌体能够转换为溶源状态。鉴于该噬菌体基因组中不包含任何毒力基因和耐药性基因，表明该噬菌体在病原菌控制方面具有一定的应用潜力。然而实验中发现，与上述的玫瑰杆菌OCh114一样，在噬菌体感染胁迫下，宿主菌同样可快速产生对该噬菌体的抗性，而这也是限制该噬菌体应用的一个重要瓶颈。<br>　　5、避免宿主菌产生抗性突变的策略研究。以一株海洋中的人畜共患致病菌-溶藻弧菌为宿主探索了一种避免宿主产生抗性突变的策略，以解决单一噬菌体感染时宿主易产生抗性，进而削弱噬菌体对病原菌的控制效果的问题。具体操作为首先用野生株为宿主分离一级噬菌体，然后用一级噬菌体感染野生株时产生的突变株为第二宿主来分离二级噬菌体，最后构建两级噬菌体的组合物。实验证实，与以野生株为宿主重复分离同级噬菌体而构建的噬菌体组合物相比，通过这种策略得到的噬菌体组合物确实能更有效的抑制抗噬菌体突变株的爆发，大大提高噬菌体鸡尾酒的筛选速度和杀菌效率。该研究也为噬菌体鸡尾酒的开发提供了更有效的方法。