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摘要随着蛋白质组学和质谱技术的发展，基于质谱的蛋白质组学技术被应用于生命科学的多个领域，交联质谱技术是解析二硫键及发现RNA结合蛋白(RNA Binding Protein，RBP)的有效方法，本论文利用基于质谱的蛋白质组学技术开发了新的大规模二硫键位点富集及鉴定方法，研究了体外诱导的小鼠B细胞(Induced Germinal Centers B cells，iGCB)及其分化的浆细胞(Induced Plasma Cells，iPC)的RNA结合蛋白。此外，蛋白质组学、转录组学等多组学技术已逐渐成为系统地研究生物学规律和机制的有力工具，本论文利用多维蛋白质组学及转录组学研究了宿主细胞对Cas9蛋白的响应。<br>　　论文第一部分是大规模鉴定二硫键位点的研究。二硫键是体内的一种常见的蛋白翻译后修饰，是半胱氨酸的两个巯基被氧化形成的共价键，属于体内的一种特殊交联形式。二硫键对稳定蛋白空间结构和调节蛋白生物活性等有着重要的作用。因此蛋白质二硫键位置的确定是研究蛋白折叠和三维结构的重要方向。虽然高分辨质谱技术已经成为研究二硫键的有效方法之一，但由于目前缺乏二硫键富集的有效方法，且二硫键交联形式多样，谱图复杂，利用质谱在组学水平上鉴定二硫键仍然困难重重。<br>　　本课题基于羧肽酶Y建立了一个新的二硫键高效富集方法，称为CADI（CarboxypeptidaseY Assisted Disulfide Identification），该方法基于线性多肽对羧肽酶Y酶解不可抗性和二硫键位点对羧肽酶Y酶解的抵抗作用达到富集含有二硫键的多肽目的。另外我们还根据羧肽酶Y酶切特征重新构建了一个用于交联多肽鉴定的线性数据库，该数据库通过组合二硫键交联的两条多肽序列，将交联多肽所有的理论碎片信息包含在线性序列中，使其可利用常规的蛋白质组学软件如Mascot、MaxQuant进行二硫键位点的鉴定。<br>　　利用该方法我们鉴定到了10条标准多肽可形成的55个理论二硫键中的53个二硫键，并鉴定到了单抗类药物Rituximab所有的链内二硫键和4种标准蛋白（鸡血清白蛋白、鸡溶菌酶、人转铁蛋白和RNase A）混合物中的16个二硫键交联位点。此外我们还研究了diamide引起的HeLa细胞内大规模的二硫键水平变化，通过MaxQuant使用非标记定量的方法定量了621个二硫键位点，其中diamide引起的二硫键位点水平的升高的蛋白多参与蛋白折叠与翻译、RHO GTPases通路等氧化应激相关的通路。<br>　　本文第二部分是Cas9蛋白相关多组学研究。CRISPR-Cas9技术是目前在基础研究中广泛使用的基因编辑技术，并有望治疗人类遗传疾病。但是CRISPR-Cas9技术仍存在许多的挑战，脱靶效应和人体对Cas9酶的免疫反应是两个研究热点。而目前对于来源于细菌的Cas9酶是否影响宿主细胞的蛋白质稳态还不清楚。本课题应用了多组学分析，包括转录组，蛋白质组，磷酸化蛋白质组，Cas9相关蛋白质相互作用组，蛋白质合成和组蛋白表观遗传修饰来研究细胞对Cas9表达的反应。多组学的数据表明Cas9对宿主细胞基因表达、蛋白翻译和磷酸化信号通路的影响均非常小。在Cas9的AP-MS实验中我们发现Cas9与PARPl之间有相互作用，且Cas9会影响PARP1的活性，此外Cas9还与DNA-PKcs复合体中的多个蛋白也存在相互作用，而PARP1和DNA-PKcs是DNA修复功能中的重要蛋白。我们的发现一方面反映了CRISPR-Cas9技术对细胞稳态没有巨大的影响，另一方面也揭示了CRISPR-Cas9技术可能面临的风险，Cas9的多组学数据对CRISPR-Cas9未来的临床安全研究具有重要的意义。<br>　　本文第三部分是体外诱导的小鼠B细胞及其分化的浆细胞的RNA结合蛋白质组分析。B细胞是体液免疫的主要细胞，而浆细胞是B细胞的终端分化细胞，是体内抗体的唯一来源，目前B细胞分化成浆细胞这一过程中的调控机制还未完全清楚，本课题使用紫外交联技术和oligo(dT)磁珠富集了Jurkat、iGCB和iPC细胞的mRNA与蛋白相互作用，分别发现了518、333和525个RNA相互作用蛋白，是目前免疫细胞种类较为丰富的RBP数据库。其中iGCB细胞和iPC细胞的mRNA相互作用蛋白与核糖体合成、蛋白翻译、mRNA剪切、无义介导的mRNA降解(Nonsense-Mediated Decay，NMD)等通路高度相关。之后我们选取了B细胞和iPC细胞中9个候选RBP做了CRISPR-Cas9基因敲除实验，发现了多个基因与B细胞的增殖和分化相关。我们的工作为RBP在B细胞的发育与分化中的调控机制研究奠定了一定基础。<br>　　综上，本论文围绕基于质谱的蛋白质组学，分别研究了二硫键的大规模富集与鉴定，Cas9核酸酶诱发的细胞响应多组学数据及iGCB和iPC细胞的mRNA结合蛋白质组，这些工作在一定程度上推动了相关领域的进展。