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摘要基因敲除小鼠是研究哺乳动物基因功能必不可少的工具。利用传统的基因打靶技术，每个小鼠只能敲除一到几个基因，这在很大程度上限制了基因研究的通量，长期以来，构成功能基因组学的一个瓶颈。本项目旨在打破这个瓶颈。为此，我们结合了CRISPR-Cas9和Cre/LoxP系统，研发了一种新型嵌合小鼠MARC(Mosaic Animal based on gRNA and Cre)。在MARC小鼠中，每个细胞表达一种gRNA，只敲除一个靶区域，但不同细胞可敲除多个不同靶区域。因此，理论上，MARC可用于遗传筛选，也可繁育出大量传统的单基因敲除小鼠品系，从而大幅度提高基因功能研究的通量。<br>　　MARC技术的核心是一个由修饰后的U6启动子启动表达的转基因文库。文库由一系列串联重复的不同gRNA基因组成，每一个gRNA两侧均有LoxP位点。转基因文库在Cre的介导下可以发生重组，使一个细胞随机表达一种gRNA、多种细胞表达多种gRNA，引导Cas9敲除相应的靶基因，从而产生嵌合小鼠。这个技术的风险在于:gRNA转基因文库因为其高度重复的序列，可能易被删除或发生表观沉默。<br>　　为了验证概念(proof-of-concept)，我们构建了三个gRNA文库:11-mer、31-mer和61-mer，分别包含11个、31个和61个gRNA基因，靶向生物标记物（细胞表面受体）。将11-mer和31-mer文库插入小鼠的一个安全港(H11位点)，将61-mer文库随机插入小鼠基因组，再引入Cas9和CreER转基因，产生MARC-11、MARC-31和MARC-61品系。发现所有MARC品系，gRNA文库都能稳定存在、传代，并在Cre的作用下有效地重组。可是，H11MARC-31小鼠的U6启动子被甲基化，抑制gRNA表达，但仍实现了一定程度的靶基因敲除。相反，MARC-61小鼠的启动子没有被甲基化，其gRNA高表达，能有效地敲除靶基因，从而可以进行体内遗传筛选。这些结果表明，MARC对于打破功能基因组学的瓶颈，有巨大潜力。