检索历史 清除

摘要发育生物学两个非常重要的事件即:胚胎和原始生殖细胞的发育，二者均伴随着剧烈的表观遗传重编程，同时众多关键的基因和调控区域在这过程中扮演着重要的角色，具有不同的时空调控谱。由于技术的限制，一些重要的功能元件和修饰在发育过程中的作用并没有被详细地研究，包括印记调控区、功能基因、DNA甲基化、组蛋白的修饰、RNA的甲基化等。博士期间，我主要的工作是利用半克隆技术和基因编辑技术揭示了印记调控区域(H19-DMR和IG-DMR)和DNA甲基化在胚胎发育过程中的作用，以及重要的功能基因（Trim37和Dnd1）在原始生殖细胞发育中的功能。<br>　　2012年，我们实验室首次建立了小鼠的孤雄单倍体胚胎干细胞(Androgenetic haploid embryonic stem cells，AG-haESCs),同时证明这些细胞通过卵胞质注射，能够代替精子使卵母细胞“受精”产生健康的半克隆小鼠。因此，这些细胞被称为“人造精子细胞”，整个技术路线被称为半克隆技术。然而，半克隆胚胎的发育率低。进一步研究发现，AG-haESCs中H19-DMR和IG-DMR(Differential DNA methylation region)的甲基化丢失严重，同时，发育异常的半克隆胚胎也存在H19-DMR和IG-DMR的甲基化丢失;通过删除AG-haESCs的H19-DMR和IG-DMR模拟该区域的甲基化状态，使得半克隆小鼠的出生效率提高了10倍。H19-DMR和IG-DMR是最早发现的父本基因组上的差异甲基化区域，调控这两个印记区域中H19，Igf2，Gtl2，Dlk1，Dio3等印记基因的表达。大量研究显示H19-DMR和IG-DMR在胚胎发育中起到重要的作用，但是，二者是如何协同调控胚胎的发育却一直没有被阐释。<br>　　我们利用“人造精子细胞”介导的半克隆技术首次揭示父源印记调控区域(H19-DMR和IG-DMR)在胚胎发育过程中的时序调控作用;通过形态学和转录组分析，发现这两个DMR对着床前胚胎发育无明显调控作用;其中H19-DMR在妊娠的中期通过调控胎盘的发育，对胚胎正常发育具有关键调控作用;IG-DMR在妊娠的后期通过调控一系列印记基因（包括Dlk1，Gtl2，Dio3等）的正常表达，对胚胎的存活具有重要作用;进一步在缺失H19-13kb(包括H19和H19-DMR)的AG-haESCs中敲除IG-DMR，获得的TKO-AG-haESCs具有更好地支持半克隆小鼠发育和出生的能力。该研究显示“人造精子细胞”介导的半克隆技术是研究胚胎发育印记调控的有效工具。<br>　　“人造精子细胞”易于在体外进行基因编辑，结合CRISPR-Cas9技术可以一步获得基因纯和敲除的个体，实现个体水平的遗传筛选。首先，我们通过优化CAS9蛋白在“人造精子细胞”中的表达系统，显著提升了获取基因纯和敲除小鼠的效率。原始生殖细胞(Primordial germ cell，PGC)发育是我们一直关心的重要科学问题，我们利用优化的个体水平筛选系统去寻找对PGC发育重要的基因。通过对野生型E9.5PGC的RNA-seq数据的分析，我们选择了其中高表达的E3泛素连接酶TRIM家族的33个基因进行个体水平的遗传筛选。<br>　　筛选结果显示Trim37对于小鼠PGC的发育至关重要，因此，我们通过受精卵注射CRISPR-Cas9建立了2个Trim37敲除的小鼠模型，发现它们的PGCs在E9.5显著减少，E12.5PGCs基本完全缺失，成年的雌雄个体均完全缺失生殖细胞。进一步，通过单细胞的RNA-seq分析E9.5PGC的表达谱，发现Trim37突变的小鼠PGC的命运倾向于由生殖细胞向体细胞转变。同时，我们发现Trim37敲除后并没有伴随PGC凋亡信号的增加，暗示着Trim37是通过改变细胞命运导致PGC数目改变。我们进一步构建了Trim37在PGCs中条件性敲除的小鼠模型（Blimp1-cre介导），得到了相同的PGCs完全缺失的表型，证明了TRIM37是通过影响PGCs本身发育从而影响其迁移和增殖的过程。进一步，我们通过构建TRIM37蛋白酶活位点突变的小鼠模型，证明了E3泛素连接酶的活性对PGC发育的重要作用。相关研究表明，该基因的突变会导致人类Mulibrey nanism疾病（肌肝脑眼侏儒）和不孕不育的发生。我们发现携带人类遗传病中Trim37突变位点的小鼠模型也显示PGC发育失败，暗示TRIM37在人类生殖细胞发育过程中的重要作用。<br>　　“人造精子细胞”介导的半克隆技术结合CRISPR-Cas9技术可以进行个体水平功能基因的遗传筛选。2016年David R.Liu课题组建立了基于CRISPR-Cas9技术的高效诱导基因组单一核苷酸突变的胞嘧啶碱基编辑器(BE3)，可以在不产生DNA双链断裂的情况下，将靶位点C/G转变为T/A。我们推测，将碱基编辑技术和半克隆技术结合起来，可进行个体水平功能氨基酸位点的遗传筛选。首先，我们在小鼠ESCs中，通过将BE3蛋白质的氨基端和羧基端分别加上一个核定位序列，建立了高效的单碱基编辑系统。随后，我们将该系统应用于小鼠“人造精子细胞”上，发现优化的BE3不仅可以在“人造精子细胞”上实现高效的单碱基编辑，将携带BE3的“人造精子细胞”注入卵子还可以高效地产生纯合点突变的半克隆小鼠。进一步，我们向“人造精子细胞”中导入一个针对小鼠PGC发育密切相关的Dnd1基因不同核苷酸位点的sgRNA慢病毒文库（含77个sgRNAs），发现能在半克隆胚胎中高效地诱导不同位点的单碱基突变。通过两轮的遗传筛选，我们发现并验证了DND1的E59K、V60M、P76L和G82R对PGC的发育具有重要作用。最后，通过对蛋白质结构的预测、突变后蛋白的稳定性、蛋白质与蛋白质相互作用等多个层次分析发现这些位点对于DND1蛋白质稳定性和其与其它蛋白质的相互作用起着关键作用。<br>　　BE3系统通过受精卵注射，可以对靶位点进行碱基突变产生提前终止子，从而实现靶基因的敲除。因此，我们推测利用该策略可以在胚胎早期实现多基因的同时敲除。为此，我们首先建立了植入前胚胎中测定编辑效率的筛选系统，发现hA3A-eBE-Y130F编辑器具有最高效的编辑效率和最低的脱靶效应。同时，为了便于快速地设计碱基编辑的sgRNA，我们建立了Base-avenger的网站。基于此，我们建立了Multi-Stop的编辑系统，可以快速对多个基因进行同时敲除。首先，我们对TET家族的Tet1/2/3侣进行同时敲除，发现合子时期TET蛋白质的缺失导致胚胎发育阻滞在E9.5。同时，我们发现Dnmt1-KO和Dnmt3a/3b-DKO的胚胎原肠运动正常发生，发育阻滞在E8.5;而Dnmt1/3a/3b-TKO的胚胎发育阻滞在E7.5的原肠运动时期，这些结果与通过生殖细胞介导（Zp3-cre和Stra8-cre）的Dnmt1/3a/3b-TKO胚胎表型相同，证明Multi-Stop的编辑系统的可靠性。进一步，我门在Dnmt1-KO，Dnmt3a/3b-DKO和Dnmt1/3a/3b-TKO的基础上同时敲除Tet1/2/3，发现表型未发生明显改变。这些结果暗示，维持DNA甲基化的DNMT1和起始性DNA甲基化的DNMT3A/3B共同维持着小鼠原肠运动的发生，同时不依赖于TET家族蛋白。