高胆固醇与分化型甲状腺癌患病风险的相关关系及其机制研究-论文-万方医学网

高胆固醇与分化型甲状腺癌患病风险的相关关系及其机制研究

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摘要第一部分高胆囿醇与分化型甲状腺癌患病风险的相关关系 　　研究目的 　　该研究分析了2013年1月-2019年12月期间，在山东大学附属千佛山医院行甲状腺手术的3748名患者的临床资料，旨在探讨在中国人群中高胆固醇与分化型甲状腺癌患病风险的相关关系，为分化型甲状腺癌高发病率的流行病学析因分析提供数据支持。 　　研究背景 　　近几年来，大量临床研究和基础实验致力于甲状腺癌高发病率的流行病学析因分析及机制研究，其中代谢相关的危险因素成为研究热点。流行病学研究发现，包括肥胖、糖尿病和胰岛素抵抗等在内的代谢相关因素与甲状腺癌发病率的升高有着密切的关系。既往研究发现，高脂血症是甲状腺癌患病的危险因素之一。然而，高胆固醇与甲状腺癌患病的关系尚不明确。 　　材料与方法 　　本研究共纳入3748名患者，所有患者均进行了甲状腺手术且均有术后病理结果(2013年1月-2019年12月，山东大学附属千佛山医院)，其中分化型甲状腺癌患者2021人，作为对照的甲状腺良性结节患者1727人。收集并统计所有纳入患者的人口学特征、病史及临床血液检验资料等。汇总2013年-2019年间甲状腺结节良性、恶性结节的病理学特征，分析分化型甲状腺微小癌的患病率与时间的关系。同时，应用大样本Z检验和卡方检验挖掘分化型甲状腺癌患病风险的相关因素。采用交互作用分析、分层分析以及多变量logistic回归分析模型分析高胆固醇血症、血清总胆固醇水平和分化型甲状腺癌患病风险的相关关系。该临床研究方案经过我院伦理委员会审批，同时在临床试验协议注册和结果系统网站上注册(NCT03006289，https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03006289)。 　　结果 　　①纳入的3748名因甲状腺结节行甲状腺手术的患者，其中53.92％(2021人)为分化型甲状腺癌，46.08％(1727人)为甲状腺良性结节。分化型甲状腺癌患者中，有60.52％(1332人)为单病灶，39.21％(683人)为多发病灶，剩余0.27％(6人)为病灶仅局限于淋巴结;并且46.86％(947人)伴有淋巴结转移，43.49％(879人)无淋巴结转移，9.65％(195人)未进行淋巴结清扫或病理检验;41.81％(845人)肿瘤最大病灶直径≥1cm，57.30％(1158人)小于1cm，剩余0.89％(18人)甲状腺无病灶。 　　②比较不同直径的分化型甲状腺癌随时间变化的患病差异显示，总体来看，直径＜1cm和直径在1-2cm的分化型甲状腺癌患病人数均有所增加，而直径≥2cm的分化型甲状腺癌人数无显著增加。卡方检验分析显示分化型甲状腺微小癌在2013年-2019年间总体患病率差异具有统计学意义(分化型甲状腺微小癌占所有分化型甲状腺癌的比例(P=-0.001)，及分化型甲状腺微小癌占手术总量的比例(P＜0.001))。但，当将每一年的占比与上一年度占比之间的差异进线比较分析时，并未发现分化型甲状腺微小癌的患病率随时间而增加的统计学差异。 　　③相比甲状腺良性结节患者，分化型甲状腺癌患者具有更高的血清总胆固醇水平(P＜0.001)。在校正高胆固醇血症的影响后，年龄(P＜0.001)、甘油三酯(P=0.003)和促甲状腺激素(P＜0.001)是影响高胆固醇和分化型甲状腺癌患病风险相关的混杂因素。年龄小于45岁的患者发生分化型甲状腺癌的风险是45岁以上患者的2.08倍(优势比=0.48，95％置信区间=0.38-0.61，P＜0.001)。高促甲状腺激素水平与分化型甲状腺癌患病风险增加高度相关(P＜0.001)。 　　④多变量logistic回归分析显示，没有高胆固醇血症的患者者发生甲状腺结节的恶性风险明显减低(比值比-0.75，95％置信区间=-1.39--0.12，P=0.02)，即，高胆固醇血症可使分化型甲状腺癌的患病风险增加33％(模型Ⅱ:1/0.75)。与血清总胆固醇(＞5.7mmol/l)水平升高相比，血清总胆固醇水平越接近正常(3.17-5.7 mmol/l)，甲状腺结节恶性风险越小，差异有统计学意义(比值比=-0.67，95％置信区间--1.31--0.03，P=0.040)。但在总胆固醇较低组(＜3.17mmol/1，优势比=0.43，95％置信区间=-1.22-2.09，P=0.068)中没有发现这种差异，提示低胆固醇血症并不是甲状腺结节恶性风险的保护因素。 　　结论 　　甲状腺癌的患病人数、患病率逐年增加，以直径＜1cm和直径在1-2cm的分化型甲状腺癌患病人数增加明显，而直径≥2cm的分化型甲状腺癌患病人数无显著增加。分化型甲状腺微小癌在2013年-2019年间总体患病率差异具有统计学意义，但每一年与上一年度之间的差异并不存在分化型甲状腺微小癌的患病率随时间而增加的统计学意义。进一步的数据分析提示:在中国人群中，高胆固醇与分化型甲状腺癌患病风险相关，而低胆固醇血症并不是甲状腺结节恶性风险的保护因素。 　　第二部分高胆固醇与甲状腺乳头状癌患病风险相关的机制研究 　　研究目的 　　应用生物信息学技术，挖掘高胆固醇血症与甲状腺乳头状癌相关关系的机制。同时，通过基础研究验证高胆固醇是甲状腺乳头状癌患病、疾病进展的危险因素，分析可能的分子机制，为甲状腺乳头状癌的靶向治疗提供思路。 　　研究背景 　　近年来，越来越多的研究发现，甲状腺癌还存在着除放射性辐射以外的其他可干预的危险因素，其中代谢因素成为近几年的研究热点和难点。有研究报道，肥胖、高胰岛素血症、高血糖等与甲状腺癌患病风险呈正相关，其具体机制尚不清楚，可能与几个潜在机制有关，如高血糖增加氧化应激、高胰岛素血症相关途径和非高胰岛素血症相关途径等，而后者主要包括雌激素/雄激素失衡、脂肪因子、慢性“低度”炎症、免疫反应改变以及氧化应激引起的DNA损伤等。此外，升高的促甲状腺激素和甲状腺功能不全可能会加速甲状腺乳头状癌细胞生长和/或增加细胞亚型变异，并与其它生长因子和分子改变相互作用。然而，这些机制大多只是基于其他癌症中的推测，在甲状腺癌中仍需进一步探索。因此，该研究在临床研究部分发现高胆固醇与分化型甲状腺癌患病风险相关的基础上，进一步进行机制的研究。 　　材料与方法 　　①应用生物信息学分析法，获得高胆固醇血症与甲状腺乳头状癌的共同靶基因，利用Cytoscapse构建“甲状腺乳头状癌-高胆固醇血症共同靶基因网络图”。将相关基因放入DAVID数据库中进行GO富集分析和KEGG富集分析，基于相关通路富集的基因数量和P值，选取了前10位的KEGG通路和GO条目进行作图，以挖掘并分析促癌风险、疾病进展的通路及功能。 　　②采用CCK8实验筛选胆固醇对细胞的最佳干预浓度和干预时间;采用免疫荧光染色定性和半定量检测人正常甲状腺滤泡上皮细胞株(Nthy-ori3-1细胞)中甲状腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)的表达。同时，应用Real-timePCR实验检测Nthy-ori3-1细胞中TgmRNA、甲状腺肿瘤干细胞特异性标记分子阶段特异性胚胎表面抗原-1(stage-specific embyronic antigen-1，SSEA-1)mRNA的表达;此外，采用Edu法检测人甲状腺乳头状癌细胞株(BHP10-3细胞)中癌细胞的增殖，采用Transwell迁移实验和WesternBlot法检测胆固醇对BHP10-3细胞迁移及迁移蛋白(基质金属蛋白酶9，matrixmetalloproteinase9，MMP9)的影响。 　　③采用Real-timePCR实验分别检测Nthy-ori3-1细胞和BHP10-3细胞中10个共同靶基因的表达，分析其差异性。同时，分别给予胆固醇干预两组细胞株，检测共同靶基因的表达。 　　④使用KaplanMeierplotter在线网站分析10个共同靶基因对于该网站收录的502个甲状腺癌病人总生存期的影响。结果 　　①生物信息学分析挖掘出甲状腺乳头状癌与高胆固醇血症的共同靶基因为:ABCC3,AGTR1,CD36,CHI3L1,CXCL12,DPP4,FN1,HBA1,MMRN1,PPARGC1A。GO富集分析的生物学功能分析显示，靶基因主要富集在趋化因子介导的信号通路(GO:0070098)中。KEGG通路分析提示，靶基因基因主要富集在趋化因子信号通路、肿瘤中蛋白聚糖、黏着斑、肌动蛋白细胞骨架的调节等通路和分子功能中。 　　②在一定浓度内Nthy-ori3-1细胞存活率随着胆固醇浓度的增加而增加，在胆固醇浓度为25umol/L时，对Nthy-ori3-1细胞存活率影响最大;当胆固醇浓度继续增加时，Nthy-ori3-1细胞存活率则下降。25umol/L胆固醇在不同时间(0、24h、48h、72h)对Nthy-ori3-1细胞活性的影响，结果发现，24h时胆固醇对细胞存活率影响最大。因此，后续实验选取25umol/L和24h作为最佳浓度和最佳作用时间。以对照组中的TgmRNA表达水平为对照，胆固醇干预后，Nthy-ori3-1细胞TgmRNA表达水平显著增加(P＜0.001)。以对照组中的SSEA-1mRNA表达水平定义为1，胆固醇干预后SSEA-1mRNA表达水平为2.67，具有统计学差异(P=0.037)。 　　③对于BHP10-3细胞，在一定浓度内，细胞存活率随着胆固醇浓度的增加而增加，在胆固醇浓度为25umol/L时，对BHP10-3细胞存活率影响最大;当胆固醇浓度继续增加时，BHP10-3细胞存活率则下降。分别检测25umol/L胆固醇在不同时间(0h、24h、48h、72h)对BHP10-3细胞活性的影响，结果发现，24h时胆固醇对细胞存活率影响最大。因此，定义上述最佳浓度和最佳作用时间。以对照组中的TgmRNA表达水平为对照，胆固醇干预后，TgmRNA表达水平明显增加(P=-0.037)。EdU细胞增殖实验结果显示，与对照组相比，胆固醇干预能够显著增加BHP10-3细胞的增殖，差异具有统计学意义(P=0.037)。Transwell迁移实验和MMP9蛋白的Westernblot检测显示，与对照组相比，胆固醇显著增加了BHP10-3细胞中迁移及MMP9蛋白的表达，且有统计学意义(P=0.037)。 　　④在无胆固醇干预下，BHP10-3细胞中DPP4mRNA表达显著高于Nthy-ori3-1细胞;而除ABCC3mRNA在两种细胞中的的表达无显著差异外，其余8个基因在BHP10-3细胞中的表达均显著高于Nthy-ori3-1细胞。经25umol/L胆固醇干预24h后，HBA1mRNA、CHI3L1mRNA、CXCL12mRNA和DPP4mRNA在Nthy-ori3-1细胞和BHP10-3细胞中的表达变化趋势一致，并且差异具有统计学意义。其中，HBA1mRNA在Nthy-ori3-1细胞和BHP10-3细胞中的表达均显著升高，CHI3L1mRNA、CXCL12mRNA和DPP4mRNA则均显著降低。其中，CHI3L1mRNA和CXCL12mRNA的变化趋势在是否加入胆固醇干预一致。 　　⑤KaplanMeierplotter在线网站分析10个共同靶基因对甲状腺癌病人总生存期的影响，结果显示:DPP4、HBA1、PPARGC1A的差异表达与甲状腺癌的总生存期显著相关，其中高水平PPARGC1A可显著降低甲状腺癌患者的总生存期，风险比为3.61，且结果具有统计学意义(P=-0.0063)。而低水平的HBA1与DPP4与甲状腺癌不良预后相关，显著降低患者的总生存期(P=0.027和P=0.0011)。 　　结论 　　①高胆固醇血症与甲状腺乳头状癌的共同靶基因为:ABCC3，AGTR1，CD36，CH13L1，CXCL12，DPP4，FN1，HBA1，MMRN1，PPARGC1A。趋化因子介导的信号通路、肿瘤中蛋白聚糖、黏着斑、肌动蛋白细胞骨架的调节等参与了二者之间的相互作用关系，提示了胆固醇导致甲状腺癌患病风险增加、疾病进展的主要作用机制。 　　②在Nthy-ori3-1细胞中，胆固醇可提高细胞存活率、TgmRNA表达和肿瘤干细胞表面标记分子SSEA-1mRNA的表达。在BHP10-3细胞中，胆固醇可提高细胞存活率、TgmRNA表达、以及癌细胞的增殖和迁移能力，提示了胆固醇在甲状腺癌患病风险增加、疾病进展中的作用。 　　③BHP10-3细胞中DPP4mRNA表达显著高于Nthy-ori3-1细胞;而除ABCC3mRNA在两种细胞中的的表达无显著差异外，其余8个基因在BHP10-3细胞中的表达均显著升高。胆固醇干预Nthy-ori3-1细胞和BHP10-3细胞后，可显著降低两种细胞中CHI3L1mRNA、CXCL12mRNA、DPP4mRNA的表达水平，而提高HBA1mRNA的表达水平。 　　④生存分析结果提示:DPP4、HBA1、PPARGC1A的差异表达与甲状腺癌的总生存期显著相关，其中高水平PPARGC1A可显著降低甲状腺癌患者的总生存期，而低水平的HBA1与DPP4与甲状腺癌不良预后相关，显著降低患者的总生存期。胆固醇作用于PTC的致病、促进疾病进展的机制与HBA1、CXCL12、CHI3L1无关，而胆固醇可能是通过降低DPP4mRNA的表达，影响细胞的增殖和迁移，参与胆固醇对PTC疾病进展的机制。