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摘要肝内胆管细胞癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)是一种起源于肝内胆管上皮细胞的原发性肿瘤，其发病率是继肝细胞癌之后的第二大最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，约占所有原发性肝脏肿瘤的10％，且近几年肝内胆管细胞癌的发病率呈上升趋势。所以探讨肝内胆管细胞癌发生发展的分子机制和小分子联合药物治疗有着重要的意义。本论文内容主要分为以下两部分:<br>　　一、肿瘤相关成纤维细胞vCAF亚群调控肝内胆管细胞癌增殖的功能及机制研究<br>　　肝内胆管细胞癌的一个显著的病理特征是呈现结缔纤维组织异常增生(desmoplasia)，提示癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast，CAF)在肝内胆管细胞癌中发挥重要作用。我们的合作者通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)在肝内胆管细胞癌病人的癌组织和癌旁组织共定义了6个不同的成纤维细胞亚群，其中MCAM(CD146)阳性的具有血管特征的成纤维细胞亚群(vascular CAF，vCAF)占比最高(56.7％)，且组织定位与肿瘤细胞紧密接触，提示其与肝内胆管细胞癌的肿瘤细胞之间存在强烈的相互作用。因此在本课题中，我们主要关注其中占比最高的vCAF与肝内胆管细胞癌的相互作用，并进行功能和机制的验证。我们从新鲜肝内胆管细胞癌组织中分离培养并流式分选扩增MCAM阳性的vCAF亚群进行功能实验，发现vCAF显著促进肝内胆管细胞癌增殖并诱导其表观遗传调控相关的基因显著改变，尤其是EZH2明显上调。接下来根据我们单细胞RNA测序数据中配体-受体对的分析和细胞因子芯片分析提示IL-6/IL-6R信号轴可能在vCAF与ICC相互作用中发挥重要作用，进一步功能实验表明vCAF分泌的IL-6能显著增强肿瘤细胞增殖功能改变和诱导其表观遗传基因EZH2的上调表达。我们还发现肿瘤外泌体中富集的miR-9-5p能够反过来上调vCAF中IL-6的表达，进而参与vCAF调控ICC的恶性进程。<br>　　这部分课题从肿瘤微环境的视角探讨vCAF与ICC的相互作用及诱导肝内胆管细胞癌细胞中表观遗传改变的机制。此研究有望加深我们对肿瘤间质微环境在肝内胆管细胞癌发生发展中的功能及分子机制的理解。<br>　　二、β-拉帕醌联合帕博西尼抑制肝内胆管细胞癌细胞及肿瘤干细胞球增殖的研究<br>　　肝内胆管细胞癌发病隐匿，早期无明显症状，确诊时多处于晚期。大多数患者在诊断时表现为不可切除的晚期病情，预后极差。多项研究表明，在多种肿瘤中存在一部分与肿瘤发生真正相关的肿瘤起始细胞或肿瘤干细胞的亚群，提示肿瘤干细胞与肿瘤的复发转移密切相关，肿瘤干细胞已成为当前肿瘤治疗和干预的重要研究热点。然而，肿瘤患者组织中存在的肿瘤干细胞比例较低，且在原代分离时，细胞表面抗原会被酶消化破坏，导致肿瘤干细胞的分离效率极低。相比之下，利用肿瘤细胞系体外形成的肿瘤干细胞球(tumor sphere)具有类似于肿瘤干细胞的部分特征，这种简便易行的体外肿瘤干细胞球已被越来越多地用于富集包括肝内胆管细胞癌在内的许多癌症中的肿瘤干细胞样细胞。因此本论文采用这种简便易行的肿瘤干细胞球体外培养体系初步筛选可能靶向肝内胆管细胞癌肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)的小分子药物。<br>　　我们利用小分子化合物redox库筛选对肿瘤干细胞球具有显著抑制的小分子。初步结果发现β-拉帕醌(β-lapachone)能够显著抑制肝内胆管细胞癌细胞及肿瘤干细胞球的增殖。进一步将β-拉帕醌与帕博西尼(palbociclib)联用，通过CCK8实验、肿瘤克隆形成实验、肿瘤干细胞球体外形成实验等方法检测，结果表明联用后抑制肿瘤细胞效果更加显著。我们通过实时定量PCR及Western印迹分析检测肿瘤干性相关基因，发现β-拉帕醌能够下调肿瘤干性相关基因的表达。<br>　　此部分课题分析了β-拉帕醌对肝内胆管细胞癌细胞的体外抑制作用以及肿瘤干细胞球增殖的影响，初步探讨其分子作用机制，并尝试将帕博西尼与β-拉帕醌联用，分析β-拉帕醌联合帕博西尼是否对肝内胆管细胞癌细胞和肿瘤干细胞球的增殖具有抑制作用，为肝内胆管细胞癌的小分子联合药物治疗奠定了基础。