1.核仁素过表达增加肝脏糖原含量并缓解高脂饮食诱导的糖代谢紊乱；2.亚临床甲状腺功能减退症患者肠道菌群与左甲状腺素影响甲状腺激素代谢的关系-论文-万方医学网

1.核仁素过表达增加肝脏糖原含量并缓解高脂饮食诱导的糖代谢紊乱；2.亚临床甲状腺功能减退症患者肠道菌群与左甲状腺素影响甲状腺激素代谢的关系

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摘要第一部分核仁素过表达增加肝脏糖原含量并缓解高脂饮食诱导的糖代谢紊乱 　　研究背景 　　2017年全球糖尿病患者超过4.49亿，中国糖尿病发病率高达10.9％，患者2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)达1.2亿，是全球T2DM流行的中心。T2DM的发病机制十分复杂，以糖脂代谢紊乱为特征。美国国家健康与营养检查调查(NHANES 1999-2000)显示，糖尿病患者一半以上伴随血脂异常，其中约61.6％伴有甘油三酯增高，63.7％伴有高密度脂蛋白胆固醇降低。同时，非酒精性脂肪肝患者约有70％会伴有胰岛素抵抗或高胰岛素血症等糖代谢紊乱的症状，其中约44％被诊断为T2DM。 　　肝脏对于维持正常血糖稳态具有至关重要的作用——在空腹时产生葡萄糖，在餐后储存葡萄糖。但在T2DM等代谢性疾病的状态下肝脏维持血糖的功能是失调的。肝脏葡萄糖含量是糖异生、糖原分解、糖原合成、糖酵解等代谢途径的总和。其中，肝脏糖原的代谢机制并没有引起广泛的关注，是否可能通过改变糖原合成、分解和储存来延缓糖尿病的发生，我们并不清楚。 　　核仁素(Nucleolin，NCL)又称C23，是现已报道在核仁中存在的含量最多的蛋白之一，在核仁蛋白中占比约10％。NCL在多物种中都存在，且在哺乳动物中高度保守。NCL在细胞内定位广泛，穿梭于细胞核、细胞浆和细胞膜，对于DNA、RNA和蛋白质代谢发挥着多方面的调节作用。 　　NCL除了参与染色体重构、DNA复制、核糖体组装等功能外，还发现NCL具有抗血管生成、抗心肌缺血-再灌注损伤等作用，尤其是在糖尿病心肌病中，NCL呈现出抑制心肌凋亡、缓解心肌纤维化的保护作用。近年来文献报道，NCL可以响应胰岛素的刺激，但NCL是否参与机体糖代谢尚未可知。 　　研究目的 　　1.明确糖脂代谢紊乱小鼠模型中肝脏NCL的表达变化。 　　2.通过肝脏NCL过表达小鼠模型，阐明NCL过表达对肝脏糖脂代谢的作用，以及NCL过表达对高脂饮食诱导糖代谢紊乱的改善作用。 　　3.体内外实验结合，论证NCL通过ERK1/2-MNK1-GSK3β信号通路调控肝脏糖原合成。 　　4.利用多种激动剂肘印制剂以及多种细胞模型，论证NCL与CRTC2的相互作用参与肝糖输出的调节。 　　研究方法 　　1.本研究采用不同类型糖脂代谢紊乱的小鼠模型及对照，包括瘦素受体缺乏小鼠(db/db)，瘦素缺乏小鼠(ob/ob)以及高脂饮食诱导小鼠等，期间记录体重、空腹血糖(Fasting plasma glucose，FPG)等代谢指标，并利用WesternBlot检测肝脏NCL的表达量，并分析NCL与体重、FPG的相关性。 　　2.利用尾静脉注射NCL过表达腺病毒的技术，构建肝脏NCL过表达的小鼠模型，对照组注射空载腺病毒。小动物活体成像技术评估两组小鼠的感染效率，检测记录代谢指标，并评估模型小鼠的NCL过表达效率及糖脂代谢变化。 　　3.高脂饮食造模模拟糖脂代谢紊乱，普通饮食作为对照。在此基础上高脂组再分为注射过表达NCL腺病毒组和对照组，普食对照同样分组注射两种病毒。评估高脂饮食造模是否成功，评估NCL过表达效率，检测记录代谢指标，并评估NCL过表达是否能改善糖脂代谢紊乱。 　　4.利用NCL过表质粒构建NCL过表达细胞模型，通过WesternBlot检测ERK通路相关蛋白、AMPK通路相关蛋白、糖原合酶(Gycogen synthase，GS)及磷酸化等;利用ERK特异性抑制剂U0126，评估NCL过表达是否通过ERK信号通路调控GS磷酸化。 　　5.利用免疫沉淀法，明确NCL与CRTC2的相互作用关系。利用CRTC2激动剂FSK、棕榈酸等刺激，明确NCL与CRTC2的结合参与肝脏糖稳态调节的分子机制。 　　6.利用免疫沉淀串联质谱技术，鉴定NCL的相互作用蛋白，应用FunRich软件分析NCL互作蛋白的可能功能及其与糖代谢的关系。 　　研究结果 　　1.糖脂代谢紊乱小鼠模型中NCL的表达量增加 　　12周龄的雄性db/db和ob/ob小鼠相比其对照组小鼠，观察到其肝脏NCL的蛋白表达水平的增加。用普通饮食或高脂饮食喂养小鼠，在第4、8周末观察其葡萄糖耐量变化和胰岛素耐量变化，发现在第4，8周末时，高脂饮食喂养的小鼠较于对照组均出现糖耐量受损的现象，仅在第8周末高脂饮食喂养的小鼠肝脏中NCL蛋白表达增加。提示，NCL可能参与肝脏糖代谢调控，为NCL在肝脏糖代谢调控中作用的研究提供了实验证据。 　　2.肝脏NCL过表达小鼠体重、血糖、血脂和全身代谢率无明显变化，但小鼠胰岛素敏感性增强，肝脏糖原含量增加 　　(1)NCL过表达小鼠模型体重、身体成分分析及代谢表型分析 　　雌性小鼠和雄性小鼠体重、摄食量无明显差异，肝脏重量、附睾脂肪重量及相应的肝重指数、脂肪重指数无统计学差异。NCL过表达小鼠符合C57BL/6小鼠的昼夜节律特点;耗氧量、二氧化碳产量过表达组较对照组均有减少，夜间呼吸交换率降低，产热减少。 　　(2)糖耐量试验、胰岛素耐量试验 　　NCL过表达小鼠，糖耐量曲线在30分钟时峰值降低;胰岛素耐量试验，过表达小鼠较于对照，曲线显著降低，120分钟时未恢复正常血糖。提示过表达NCL增强了小鼠的胰岛素敏感性。 　　(3)NCL过表达增加肝脏糖原含量 　　肝脏糖原染色发现，NCL过表达小鼠肝脏糖原含量明显增加。肝脏甘油三酯含量和胆固醇含量均无统计学差异，而肝脏糖原含量测定显示，过表达组糖原含量增加，NCL可能与肝脏糖原代谢有关。 　　3.NCL过表达可以显著缓解高脂饮食诱导的糖代谢紊乱 　　高脂饮食造模评估，第4周末时，检测高脂饮食的造模效果，相比于普食对照组，高脂饮食组体重增加，表现出糖耐量受损、胰岛素抵抗的特征，血清胆固醇显著增加。 　　高脂喂养的注射NCL过表达病毒的小鼠，较于高脂喂养的对照病毒小鼠，过表达NCL组体重有下降趋势，糖耐量受损显著改善，胰岛素敏感性显著增强。提示肝脏NCL过表达通过改善胰岛素抵抗、促进肝脏糖原合成，改善高脂饮食诱导的糖代谢紊乱。 　　4.NCL通过ERK通路调控GS促进肝脏糖原合成 　　体外细胞实验中，过表达NCL后激活ERK1/2，MNK1苏氨酸197/202位点磷酸化增加，GS的抑制性位点丝氨酸641磷酸化水平显著降低，GS活性增加。利用ERK阻断剂后，NCL调控GS丝氨酸641位点磷酸化的效应减弱。提示，NCL通过ERK1/2-MNK1-GSK3β信号通路调控GS功能，促进肝脏糖原合成。 　　5.NCL与CRTC2的结合可能参与肝脏糖代谢的调节 　　通过免疫沉淀串联质谱色谱分析的方法，发现NCL可以结合代谢调控的分子，其中，NCL调控肝脏糖代谢的功能可能与CRTC2的相互作用有关。通过IP实验验证了NCL可以与CRTC2发生相互作用，且结合发生于细胞核内。在棕榈酸的作用下，NCL和CRTC2的相互作用减弱。另外，过表达NCL可以减轻CRTC2激动剂对肝糖输出的调控作用。提示，高脂饮食带来的肝脏糖代谢紊乱可能与NCL-CRTC2结合变化有关。 　　6.NCL与CRTC2结合构象分析 　　利用T-Tasser方法对NCL和CRTC2进行同源建模，通过ClusPro进行蛋白对接后，发现NCL与CRTC2蛋白结合的潜在位置为:NCL的精氨酸甘氨酸重复序列(Arg-Gly-Gly repeats，RGG)domain区域(650-710氨基酸);CRTC2蛋白的130-145位氨基酸和290-330位氨基酸。 　　研究结论 　　1.糖脂代谢紊乱小鼠模型中肝脏NCL表达增加，且NCL表达量与体重、FPG等指标呈正相关关系; 　　2.NCL参与肝脏糖代谢稳态调控。NCL过表达后，小鼠胰岛素敏感性显著增强，肝脏糖原含量增加;且可以显著改善高脂饮食导致的糖代谢紊乱; 　　3.NCL通过ERK1/2-MNK1-GSK3β信号通路调控GS的酶活性，进而促进肝脏糖原合成; 　　4.NCL通过在细胞核中与CRTC2的相互作用参与肝脏糖稳态调节。 　　第二部分亚临床甲状腺功能减退症患者肠道菌群与左甲状腺素影响甲状腺激素代谢的关系 　　研究背景 　　亚临床甲状腺功能减退症(Subclinical hypothyroidism，SCH)，又称亚临床甲减，表现为血清促甲状腺激素(Thyroid stimulating hormone，TSH)水平升高，而游离甲状腺素(Free thyroxine，FT4)水平正常，进一步可能发展为临床甲状腺功能减退症。SCH在全球范围内的患病率为4～10％，在我国SCH患病率已到达16.7％，患病人数众多。SCH对机体存在显著的危害，多项临床研究表明，SCH与肥胖、高血压、糖尿病、血脂紊乱、非酒精性脂肪肝、心血管疾病等代谢性疾病密切相关。目前国内外的指南通常仅推荐重度SCH患者(TSH≥10mIU/L)进行左甲状腺素(L-thyroxine，LT4)替代治疗。 　　甲状腺功能障碍往往伴随着血脂代谢异常，主要表现为血清甘油三酯(Triglyceride，TG)和总胆固醇(Total cholesterol，TC)的升高。传统的观点认为，甲状腺功能紊乱是引起血脂异常的原因之一，其主要原因可能是甲状腺激素或TSH对肝脏、脂肪组织等与脂代谢密切相关的靶器官的损伤，从而引起脂质代谢的异常调节。近年来学者们发现，血脂代谢紊乱同样也会引起甲状腺功能的损伤。目前仍缺乏对于轻度SCH患者血脂水平的研究，以及轻度SCH患者使用LT4替代治疗对血脂水平的影响。 　　我们的前期研究发现，轻度SCH患者可从LT4替代治疗中获益，但将TSH维持在正常参考值范围内所需LT4的药物剂量存在较大个体差异，且在校正了年龄、BMI、血糖、血脂等可能的影响因素后并不会消失。考虑肠道菌群在甲状腺代谢中的作用，我们推测，SCH患者LT4用药剂量的个体差异可能与肠道菌群有关。 　　在肝脏中，甲状腺激素与葡萄糖醛酸脱水缩合，促进甲状腺激素随胆汁排入肠道，在肠道中经过肠道厌氧菌产生的β-葡萄糖醛酸酶分解，可使甲状腺激素游离出来再次被肠道吸收，通过门静脉重新进入肝脏，形成肝肠循环，这一过程对于维持血清的甲状腺激素水平和正常的甲状腺激素生物学功能具有重要作用。肠道菌群作为一个被公认重要“内分泌因素”，在甲状腺激素代谢及外源性甲状腺素吸收中发挥重要作用。肠道内存在着专性厌氧菌，可以迅速分解甲状腺激素，这是甲状腺激素经肝肠循环重新进入血液循环的重要环节。另外，部分肠道菌群可以参与甲状腺激素在肠道内的储存和释放，在防止甲状腺激素水平波动方面可能有重要意义，也可以减少机体对T4补充的需求。肠道菌群还可以调节多种与甲状腺代谢相关微量元素的吸收，从而间接影响机体甲状腺激素的代谢。肠道菌群除了参与内源性甲状腺激素的代谢之外，还会影响肠道屏障从而影响外源性甲状腺激素的吸收。在菌群数量增加的情况下，LT4的需求量增加，而使用抗生素可以减少治疗过程中对LT4的调整。菌群引起的消化道功能紊乱也会导致LT4的吸收不良和需要量增加。 　　研究目的 　　本研究是一项于2017年6月进行的横断面研究，是基于2013年在山东省泰安市宁阳县开展的一项前瞻性、开放性、随机、对照、单中心随机对照临床试验的后续研究之一。本研究通过收集轻度SCH受试者的粪便及临床数据，并根据血脂水平以及LT4用药情况对受试者进行分组，探究轻度SCH受试者肠道菌群与血脂紊乱、LT4替代治疗的关系，为SCH的诊断和治疗提供新的思路和研究方向。 　　研究方法 　　本研究收集轻度SCH受试者的粪便及临床数据，并根据血脂水平以及LT4用药情况对受试者进行分组。通过针对受试者粪便样本中菌群16SrDNA进行的高通量测序来检测肠道菌群的变化，并利用α多样性分析、主成分分析(Principal component analysis，PCA)、主坐标分析(Principal co-ordinates analysis，PCoA)、典型相关分析(Canonical correspondence analysis，CCA)、部分微生物种属的丰度评估等方法，从多个方面揭示肠道微生物结构的变化。 　　具体分组方法如下: 　　1.自2013年开始研究起，利用完全随机化方法，按照1.5∶1的比例将轻度SCH患者分为给予LT4治疗的干预组(LRT组)和不给予LT4治疗的对照组(NC组); 　　2.对于干预组(LRT组)的患者，根据LT4的用药剂量分为:低剂量组(L组)、中剂量组(M组)和高剂量组(H组); 　　3.对于干预组(LRT组)的患者，根据LT4用药剂量在后续随访时是否增加分为进展组(L-D)和非进展组(L-ND); 　　4.将所有受试者根据血脂紊乱的类型分为:轻度SCH合并高TG血症组(STG组)、轻度SCH合并高TC血症组(STC组)、轻度SCH合并高TG高TC血症组(SM组)和轻度SCH血脂正常组(S组)。 　　研究结果 　　1.根据血脂水平分组后，α多样性分析、PCA分析和PCoA分析等均未发现STG组、STC组、SM组和S组肠道菌群之间具有显著差异。 　　2.干预组(LRT组)与对照组(NC组)α多样性分析、PCA分析和PCoA分析等均未发现肠道菌群之间具有显著差异。 　　3.对于低剂量组(L组)、中剂量组(M组)和高剂量组(H组)这三个不同用药剂量组，α多样性分析未发现显著差异。而PCA分析发现，与低剂量组(L组)和中剂量组(M组)相比，高剂量组(H组)的肠道菌群分布呈现出聚集的现象，尤其是在科(Family)、属(Genus)水平的PC1轴上。 　　4.对于SCH进展组(L-D组)和SCH非进展组(L-ND组)，α多样性分析未发现显著差异。而PCA分析的结果显示，L-ND组的肠道菌群在PC1轴上分布呈现集中趋势，与L-D组相比个体间离散程度明显减少;PCoA分析结果显示，L-ND组的肠道菌群在PC1轴上也呈现一定的聚集趋势。 　　5.对于甲状腺激素代谢相关菌种的相对丰度分析发现: 　　(1)低剂量组(L组)、中剂量组(M组)和高剂量组(H组)之间臭气杆菌属(Odoribacter)和肠球菌属(Enterococcus)的相对丰度具有显著性差异，高剂量组(H组)臭气杆菌属(Odoribacter)和肠球菌属(Enterococcus)的相对丰度显著升高; 　　(2)与SCH进展组(L-D组)相比，SCH非进展组(L-ND组)的理研菌属(Alistipes)、厌氧棍状菌属(A naerotruncus)和瘤胃球菌属(Rumincococcus)的相对丰度显著升高。 　　6.对所有样本和干预组(LRT组)行CCA分析发现，血清TC与LT4剂量之间的角度显示为锐角，提示这两个因素对塑造所有样本中肠道菌群特征发挥协同效应。对对照组(NC组)行CCA分析发现，血清TC水平和血清FT4水平在对于肠道菌群影响中均表现为钝角，说明这两个因素在肠道菌群塑造的过程中发挥拮抗作用。 　　研究结论 　　1.血脂紊乱不足以引起轻度SCH患者肠道菌群的显著变化; 　　2.维持轻度SCH患者TSH在正常水平所需的LT4剂量的个体差异可能与肠道菌群有关; 　　3.肠道菌群可能通过干预甲状腺激素代谢从而影响轻度SCH患者LT4的用药剂量及SCH的进展; 　　4.血清胆固醇可能与左甲状腺素在塑造肠道菌群特征中具有相关作用。