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摘要目的<br>　　幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种螺旋形状，微需氧且具有鞭毛的革兰氏阴性细菌，可粘附于人类的胃粘膜表面，是目前已发现的唯一一种在人类胃部定殖的病原菌，可导致慢性活动性胃炎，消化性溃疡，甚至胃癌。目前全球约一半的人口已经感染幽门螺杆菌。<br>　　四联疗法是目前临床上治疗幽门螺杆菌的主要方法，即使用两种抗生素，并同时联用一种胶体铋剂和质子泵抑制剂。其中最常用的抗生素为三大类，分别为:阿莫西林(β-内酰胺类)，克拉霉素(大环内酯类)和甲硝唑(硝基咪唑类)。<br>　　但是近年来，幽门螺杆菌对多种抗生素的耐药性逐渐升高，出现了临床多耐药菌株，幽门螺杆菌的清除率也逐渐降低。<br>　　双组分系统是一种重要的信号转导媒介，由传感器激酶和响应调节因子两部分组成，可感知外界条件的刺激，调节自身基因的表达从而做出应激反应。已有大量研究发现，双组分系统在细菌的多耐药中发挥重要作用。幽门螺杆菌中表达三种双组分系统，分别是CrdRS，FlgRS和ArsRS，目前还没有报道幽门螺杆菌中的双组分系统参与其耐药。本课题通过实时定量PCR检测抗生素处理后的野生株中三种双组分系统基因的表达情况，发现ArsRS的表达降低，而另外两种双组分系统的表达情况没有明显变化，因此我们将通过最小抑菌浓度，细菌克隆形成，H33342荧光累积，突变率检测等一系列实验进一步探索ArsRS是否参与幽门螺杆菌的多耐药及其耐药机制。<br>　　方法<br>　　1:使用阿莫西林，克拉霉素，甲硝唑分别处理野生株Hp26695，提取mRNA，反转录得到cDNA进行qPCR，检测三种双组分系统的表达情况，筛选出表达有显著差异的双组分系统。<br>　　2:根据同源重组原理，构建基因敲除株ΔarsS。<br>　　3:检测野生株和ΔarsS菌株对多种抗生素的MIC。<br>　　4:测量野生株与ΔarsS菌株的生长曲线。<br>　　5:检测野生株与ΔarsS菌株对多种抗生素的细菌克隆形成情况。<br>　　6:通过荧光累积实验，检测野生株与ΔarsS菌株的药物外排能力。<br>　　7:检测野生株与ΔarsS菌株中多种抗生素耐药基因的碱基突变率和突变率变化倍数。<br>　　8:分别用阿莫西林，环丙沙星，甲硝唑处理野生株Hp26695，通过转录组测序技术检测Hp基因组中所有可能参与DNA损伤修复的基因的表达情况，筛选出低表达且参与基因突变的基因mutS和mutY。<br>　　9:检测mutS和mutY在临床敏感株和临床多耐药株中的表达情况。<br>　　10:构建ArsRD52N点突变株，在ArsRD52N和ΔarsS菌株中分别检测mutS和mutY的表达情况。<br>　　11:在野生株Hp26695的基础上，构建基因敲除株ΔmutS和ΔmutY。<br>　　12:检测ΔmutS和ΔmutY菌株对多种抗生素的MIC。<br>　　13:测量ΔmutS和ΔmutY菌株的生长曲线。<br>　　14:检测ΔmutS和ΔmutY菌株对多种抗生素的细菌克隆形成情况。<br>　　15:检测ΔmutS和ΔmutY菌株中多种抗生素耐药基因的碱基突变率和突变率变化倍数。<br>　　结果<br>　　1:双组分系统ArsRS在抗生素处理的Hp26695中表达降低，CrdRS和FlgRS的表达无明显变化。<br>　　2:根据同源重组原理，成功构建基因敲除株ΔarsS。<br>　　3:对比野生株和ΔarsS菌株对多种抗生素的MIC，发现与野生株相比，ΔarsS菌株对多种抗生素的敏感性均降低。<br>　　4:比较野生株与ΔarsS菌株的生长曲线，发现敲除arsS基因后不影响细菌的生长能力。<br>　　5:比较野生株与ΔarsS菌株对多种抗生素的细菌克隆形成情况，发现ΔarsS菌株在抗生素平板上形成更多的单克隆，耐药性增强。<br>　　6:荧光累积实验中，与野生株相比，ΔarsS菌株对荧光染料H33342的累积明显升高，其药物外排能力未增强。<br>　　7:对比野生株与ΔarsS菌株的碱基突变率及突变率变化倍数，发现与野生株相比，ΔarsS菌株对多种抗生素的突变频率升高，耐药基因的突变位点也增多。<br>　　8:转录组测序结果发现5种DNA损伤修复基因低表达，根据已有文献报道，仅mutS和mutY参与细菌的基因突变。<br>　　9:mutS和mutY在临床敏感株和临床多耐药株中均低表达。<br>　　10:成功构建点突变株ArsRD52N，ArsRD52和ΔarsS菌株中mutS和mutY均低表达。<br>　　11:在野生株Hp26695的基础上，成功构建基因敲除株ΔmutS和ΔmutY。<br>　　12:与野生株相比，ΔmutS和ΔmutY菌株对阿莫西林，甲硝唑，环丙沙星的敏感性降低，对克拉霉素和四环素耐药性无差异。<br>　　13:测量野生株，ΔmutS和ΔmutY菌株的生长曲线发现，敲除mutS和mutY后不影响菌株的生长能力。<br>　　14:对比野生株与ΔmutS，ΔmutY菌株对多种抗生素的细菌克隆形成情况，发现ΔmutS和ΔmutY菌株在含有阿莫西林，甲硝唑，环丙沙星的平板上形成更多的单克隆，耐药性增强。<br>　　15:对比野生株与ΔmutS和ΔmutY菌株的碱基突变率及突变率变化倍数，发现与野生株相比，ΔmutS和ΔmutY菌株对阿莫西林，甲硝唑，环丙沙星的突变频率升高，耐药基因的突变位点也增多。<br>　　结论<br>　　ArsRS双组分系统在幽门螺杆菌的多耐药中发挥重要作用，通过降低DNA损伤修复基因mutS和mutY的表达，减弱了细菌修复突变的能力，基因突变增加，从而增强了幽门螺杆菌对多种抗生素的耐受性，适应压力环境。<br>