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摘要背景<br>　　2020年全球乳腺癌新增人数高达226万，且占全球女性新发癌症总数的24.5％，乳腺癌已成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤。除此之外，乳腺癌同时约占全球新发癌症病例的11.7％，也成为目前全球最常见的癌症，严重威胁着世界人口特别是女性群体的健康，因此致力于探究乳腺癌的新的肿瘤标记物和治疗靶点从而改善乳腺癌患者的治疗效果，具有十分积极的意义。<br>　　N6-腺苷酸甲基化(m6A)指的是腺苷酸A的第六位氮原子的甲基化修饰，最早于1970年被研究发现，约占mRNA修饰的80％。m6A甲基化修饰是一种动态改变且可逆的过程，由甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白三部分组成。值得注意的是，肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein, FTO)是第一个被发现的m6A去甲基化酶，影响多种肿瘤的发生与进展，但是在乳腺癌中相关研究较少。<br>　　线粒体是人体细胞中的重要的组成部分，是提供细胞所需要能量ATP的细胞器。除此之外，线粒体还参与活性氧的产生、细胞信号调节和生物合成代谢等细胞生理过程。值得注意的是，结构可以影响功能，线粒体动力学的改变与线粒体的功能密切相关。同时也可影响着肿瘤细胞的能量代谢，从而调控肿瘤的发生与进展，但目前具体的调控机制尚不明晰，而且m6A甲基化修饰对于肿瘤细胞线粒体的调控也是目前创新性研究内容。<br>　　方法<br>　　1.首先从山东大学齐鲁医院病理科收集30例病人乳腺癌组织和12例正常乳腺组织，Trizol提取样本RNA，RT-qPCR检测m6A去甲基化酶FTO的表达水平。IHC检测乳腺癌和正常组织石蜡切片中FTO的表达水平。<br>　　2.在MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7三种乳腺癌细胞系中使用小干扰RNA、质粒和慢病毒构建FTO干扰及过表达细胞系。比色法检测去甲基化酶FTO在乳腺癌中发挥的作用，即乳腺癌细胞系在FTO的作用下m6A甲基化水平的变化。<br>　　3.Transwell小室实验检测在MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7三种乳腺癌细胞系中，FTO对乳腺癌细胞的迁移能力的影响;CCK8、EdU及平板克隆实验检测FTO对乳腺癌细胞增殖能力的影响。<br>　　4.通过MeRIP-seq和RNA-seq测序，两者取交集，寻找FTO通过m6A依赖的方式直接调控的下游靶基因。针对于下游靶基因CDK6的m6A结合位点，构建CDK6-3'UTR野生型和突变型荧光质粒和普通表达质粒，分别进行荧光素酶报告实验和Westernblot实验。通过Westernblot及RIP实验寻找靶基因的RNA结合蛋白。<br>　　5.流式细胞仪检测FTO对乳腺癌细胞周期进展能力的影响，Westernblot及ELISA和血管形成实验继续探究CDK6的下游因子。<br>　　6.通过Confocal共聚焦显微镜探究FTO对乳腺癌细胞线粒体结构的影响，IF及Westernblot实验检测FTO对线粒体相关因子的调控作用，乳酸生成实验及ATP生成实验，探究FTO对乳腺癌细胞能量代谢水平的影响。<br>　　结果<br>　　1.通过RT-qPCR对30例乳腺癌组织及12例正常乳腺组织中FTO的表达量进行检测发现，相较于乳腺正常组织，FTO在乳腺癌组织中表达含量明显降低。用免疫组化方法检测发现，相较于乳腺正常组织，FTO在乳腺癌组织中的表达含量明显降低。<br>　　2.在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系中，敲除FTO后，乳腺癌m6A甲基化水平明显升高;过表达FTO后，乳腺癌m6A甲基化水平明显下降。<br>　　3.在MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7三种乳腺癌细胞系中，相较于对照组，敲除FTO，可促进乳腺癌细胞的迁移和增殖。<br>　　4.通过MeRIP-seq和RNA-seq测序，取交集发现，相较于对照组，敲除FTO后，CDK6的mRNA表达上调且mRNA甲基化修饰水平增高。相较于野生型，转染突变型质粒的荧光素酶活性明显下降，Westernblot中CDK6的表达明显减弱。同时敲除FTO和YTHDF1能够使得CDK6的表达水平相较于只敲除FTO下调。RIP实验发现，敲除FTO后能够促进YTHDF1与CDK6mRNA的结合。<br>　　5.细胞周期实验中发现，敲除FTO后，能促进细胞周期进展(促进乳腺癌细胞从G1期到S期的过渡)。Westernblot上发现，敲除FTO后，可以促进RB基因的磷酸化。Westernblot及ELISA实验上可证实敲除FTO后，可以上调VEGFA的表达。血管生成实验中发现，敲除FTO能促进脐静脉内皮细胞(HUVEC)的血管生成能力。Westernblot上表明CDK6可以提高致癌转录因子FOXM1的磷酸化，从而激活FOXM1且稳定其表达。而FOXM1又可分别促进LDHA及VIMENTIN的转录。<br>　　6.通过Confocal共聚焦显微镜，发现敲除FTO可以促进乳腺癌细胞线粒体由条索状到网格状的改变。Westernblot及IF上发现，敲除FTO后，促进MFF及Drp1的表达，并且可上调HIF1α的表达。通过乳酸生成实验及ATP生成实验发现，敲除FTO后可促进乳腺癌细胞的乳酸生成，且抑制ATP的合成。综上，FTO可以降低乳腺癌细胞的无氧糖酵解能力。<br>　　结论<br>　　m6A去甲基化酶FTO在乳腺癌中呈低表达，与病人的临床预后呈正相关。FTO可抑制乳腺癌细胞的迁移、增殖及周期进展。FTO以m6A依赖的方式负向调控CDK6的表达，敲除FTO后，CDK6mRNA甲基化水平上升，促进m6AReaderYTHDF1与CDK6mRNA的结合，最终促进了CDK6mRNA的翻译。FOXM1作为CDK6的下游，可促进LDHA及VIMENTIN的转录激活。一方面，FTO能够改变线粒体结构，特别是敲除FTO后，促进乳腺癌细胞线粒体的分裂，影响了线粒体动力学水平，形成低氧环境，促进低氧诱导因子HIF1α的表达，促进乳酸生成，抑制ATP合成，从而最终促成乳腺癌细胞由有氧呼吸到无氧糖酵解的过渡，导致乳腺癌细胞的迁移增殖能力增加。另一方面，转录激活波形蛋白VIMENTIN，促进上皮间质转化过程的发生，从而进一步提高乳腺癌细胞的迁移能力。<br>