TRIM36在食管癌中的功能及相关分子机制研究-论文-万方医学网

TRIM36在食管癌中的功能及相关分子机制研究

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摘要研究背景 　　食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，在男性中更为高发，是癌症相关的主要死亡原因之一。食管癌分为食管腺癌和食管鳞状细胞癌，前者主要分布在北欧和西欧，常见于消化道下段;后者则在南亚和中亚地区更为普遍，多出现在上段和中段食管中。食管癌早期症状轻微，因此很多数患者错过最佳治疗期，甚至有患者已经出现了远端转移。目前针对食管癌的治疗手段包括外科手术、放疗、化疗。但是，食管癌患者5年生存率不足20％，预后情况十分不好。因此，急需挖掘可帮助食管癌早期诊断和预后评估的标志性分子，并进一步挖掘食管癌发生和恶性化发展的相关分子机制，以期发现更多有效的治疗措施，为临床治疗提供参考。 　　三方基序(Tripartite motif, TRIM)蛋白家族成员众多，大多数蛋白都由N端的RING指结构域，一个或两个称为B盒(B-box)的锌结合基序和卷曲螺旋基序组成。由于N端RING结构域的特殊性，使得具有RING结构域的大多数TRIM家族成员都具有泛素连接酶的功能。截止目前，已发现有80种TRIM家族蛋白成员，在细胞内多种生理过程、遗传疾病和癌症发生发展等方面都起到了关键的调控作用。TRIM家族成员大多参与肿瘤的发生发展过程，在血液肿瘤中，TRIM家族部分成员通过染色体易位或异常表达的方式对癌症发展进行调控。在实体瘤中，则有更多的TRIM家族成员参与癌症的发生和恶性化进程。 　　Wnt信号通路包括Wnt/β-catenin、Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+通路Wnt/β-catenin信号通路是经典通路，其在细胞生长、胚胎发育、癌症发展等方面有关键性调节作用。在Wnt信号没有被激活时，细胞内的β-catenin浓度较低。一旦Wnt信号被激活，通过一系列的信号传导，胞内对于β-catenin表达的抑制信号被解除，β-catenin在细胞质内的表达量逐渐增加，并向细胞核内转移。进入细胞核后，β-catenin结合到相应的转录因子上，启动一系列和细胞周期、细胞凋亡有关的分子表达。 　　Wnt//β-catenin信号通路的异常活化和细胞异常增殖及多种癌症恶性化发展有关。激活的Wnt/β-catenin信号通路被认为可促进食管癌的发生及恶性化发展。Wnt/β-catenin通路的激活受到三重基序(TRIM)家族蛋白的调控。TRIM蛋白家族中的一些成员通过和Wnt/β-catenin信号通路相互作用在癌症发生及发展中发挥重要作用，例如TRIM29、TRIM28、TRIM32、TRIM44等。 　　TRIM36是一种微管结合蛋白，在胚胎发生、顶体反应、染色体分离和细胞周期进程中起作用。近年来，TRIM36已被确定为雄激素反应基因，并已报道其在前列腺癌中的肿瘤抑制作用。此外，TRIM36在非小细胞肺癌细胞系中表达量下降。在胃癌患者中，高表达TRIM36的患者接受放射治疗OS率更高，因此TRIM36也被认为是影响胃癌患者放疗效果临床预后的重要因素，并可能被视为潜在的放射敏感性基因标志。但是目前还没有报道研究TRIM36和β-catenin之间在食管癌中的相关性及其背后的临床学意义。 　　本研究首先通过TCGA网站上的食管癌RNA测序数据集分析了TRIM36的表达情况，并利用免疫组化染色明确临床样本中TRIM36及β-catenin的表达，分析了两者表达水平同食管癌患者病理特征指标及预后之间的关系。然后，在体外细胞系系统中初步探究了TRIM36对食管癌细胞系恶性增殖、细胞凋亡的影响。随后，利用生化手段和细胞功能试验探究了TRIM36同β-catenin相互作用在食管癌细胞中的功能及两者之间的调控机制。然后，在异种移植小鼠模型中验证了TRIM36及β-catenin对食管癌细胞增殖的影响。最后，检测了临床样本中TRIM36的表达量，进一步建立了TRIM36同食管癌恶性化发展之间的关系，为今后的分子机制研究及临床治疗提供参考。 　　第一部分TRIM36和β-catenin在食管癌组织中的表达及与预后的关系 　　研究目的: 　　探究TCGA网站食管癌组织RNA测序结果中TRIM36的表达量，并在临床食管癌病变组织中检测TRIM36和β-catenin，分析TRIM36和β-catenin表达水平同临床病理特征之间的关系，以及与预后的关系。 　　研究方法: 　　1.在TCGA网站下载食管癌组织及正常组织的RNA测序信息。采用R语言DESeq程序包对基因表达量比较分析。对数据进行初始数据筛选和数据标准化预处理，分析TRIM36在食管癌组织及正常组织中的表达量差异。满足Foldchangeoflog2≥1及P＜0.05被认定为具有统计学意义。利用GSEA法分析TRIM36在食管癌组织中的表达量同Wnt/β-catenin信号通路之间的相关性，预定义的基因集合从MSigDB数据库中选取; 　　2.收集2009年2月到2010年5月之间进行食管癌病变组织切除术的80名患者的临床样本。所有患者均为首次接受食管癌病变组织切除术，无其他原发性肿瘤;在术前未经过包括全身化疗及放射治疗在内的抗肿瘤治疗。对患者肿瘤大小、性别、年龄、淋巴结转移、TNM分期、生命状态等临床特征性资料进行收集统计，并对术中分离组织进行TNM分期; 　　3.利用实时荧光定量PCR的方法检测临床分离的食管癌组织及正常粘膜组织中的TRIM36的mRNA表达量; 　　4.制作组织石蜡切片，并利用免疫组化染色方法对病变组织及对照组织中的TRIM36和β-catenin进行检测; 　　5.采用费希尔精确检验(Fisher's Exact Test)分析TRIM36表达量和食管癌临床特征之间的相关性; 　　6.Kaplan-Meier法绘制生存曲线，比较载TRIM36、β-catenin不同表达水平下食管癌患者的预后。 　　研究结果: 　　1.在TCGA网站上下载的152个食管癌样本以及21个对照样本中，TRIM36在食管癌样本中的表达量显著降低(P＜0.05)。在27对随机选取的临床食管癌组织中，TRIM36在食管癌组织中的表达量显著下降(P＜0.001); 　　2.免疫组化结果表明，在80名食管癌患者汇总，53名患者显示TRIM36低表达，占总人数66.25％;27名患者为TRIM36高表达，占总人数33.75％，且主要表达在细胞质中;β-catenin在细胞质和细胞核中均有表达。其中，39例患者显示为食管癌组织β-catenin低表达，占总患者48.75％，41名患者为食管癌组织中β-catenin高表达，占总患者51.25％; 　　3.GSEA分析发现，TRIM36的表达量和β-catenin信号通路呈现负相关关系; 　　4.费希尔精确检验结果显示TRIM36在食管癌组织中的表达量同肿瘤大小(P=0.0104)、肿瘤分期(P=0.0169)、淋巴结转移(P=0.0021)、病人生存状态(P=0.0443)以及β-catenin表达量(P=0.0329)之间均存在显著的相关性(P＜0.05); 　　5.Kaplan-Meier法绘制的生存曲线显示，TRIM36低表达的食管癌患者的生存率显著低于TRIM36高表达的食管癌患者(P=0.0235);β-catenin高表达的食管癌患者的生存率低于β-catenin低表达的食管癌患者(P=0.0088);TRIM36低表达且β-catenin高表达的食管癌患者的总体生存时间最短;高TRIM36表达且β-catenin低表达的食管癌患者的总体生存时间最长(P=0.0028)。 　　结论: 　　1.TRIM36的表达量在食管癌组织中显著降低; 　　2.食管癌组织中的TRIM36的表达量和β-catenin表达量呈现负相关关系; 　　3.TRIM36在食管癌组织中的表达量同淋巴结转移、肿瘤大小、肿瘤分期、病人生存状态以及β-catenin之间均存在显著的相关性; 　　4.食管癌患者TRIM36和β-catenin的表达量同总体生存时间有关。 　　关键词:食管癌;TRIM36;β-catenin;TCGA;免疫组化;预后 　　第二部分TRIM36对食管癌细胞生长的影响及相关机制探究 　　研究目的: 　　1.探究TRIM36对食管癌细胞增殖、凋亡的影响; 　　2.探究TRIM36和β-catenin之间的相互作用及调控机制; 　　3.探究TRIM36和β-catenin之间相互作用对食管癌细胞增殖、凋亡的影响; 　　4.在体内模型中验证TRIM36对食管癌细胞增殖、凋亡的影响 　　研究方法: 　　1.利用慢病毒转导的方法构建持续过表达TRIM36及靶向TRIM36的RNA干扰细胞系; 　　2.利用CCK-8试剂盒在过表达TRIM36及靶向TRIM36的RNA干扰细胞系中检测细胞的增殖能力; 　　3.利用流式细胞仪检测过表达TRIM36及靶向TRIM36的RNA干扰细胞的细胞凋亡情况; 　　4.利用免疫印迹法检测过表达TRIM36或基因敲降TRIM36对β-catenin表达的影响; 　　5.利用免疫共沉淀法检测TRIM36和β-catenin之间的相互作用及潜在机制; 　　6.利用β-catenin抑制剂及过表达β-catenin的细胞系检测TRIM36同β-catenin相互作用对细胞增殖的影响; 　　7.在异种移植小鼠模型内检测TRIM36和β-catenin对食管癌细胞增殖的影响; 　　8.检测临床食管癌组织中TRIM36和β-catenin的表达量。 　　研究结果: 　　1.和对照细胞相比，TRIM36在食管癌细胞系中低表达; 　　2.过表达TRIM36显著抑制食管癌细胞系的增殖能力;抑制TRIM36表达则能够促进食管癌细胞增殖; 　　3.过表达TRIM36使食管癌细胞停滞在G0/G1期，同时也促进了食管癌细胞的凋亡，抑制细胞核内β-catenin表达，并降低β-catenin激活的Srvivin、CyclinD1以及c-Myc的表达。抑制TRIM36表达则得到了相反的结果; 　　4.免疫共沉淀结果显示TRIM36和β-catenin相互作用，并且TRIM36可以在β-catenin的第625位赖氨酸处对β-catenin进行泛素化修饰; 　　5.加入β-catenin的抑制剂XAV939可部分抵消抑制TRIM36对食管癌细胞增殖的促进作用。过表达β-catenin也可以部分抵消过表达TRIM36对食管癌细胞增殖的抑制效应; 　　6.在异种移植小鼠模型体内，过表达TRIM36显著抑制了食管癌细胞的生长，促进了食管癌细胞凋亡，而同时过表达β-catenin则可以部分抵消TRIM36的抑制效应; 　　7.临床食管癌病变组织样本中，和对照组织相比，TRIM36在肿瘤组织中低表达，而β-catenin则在肿瘤细胞的细胞核中高表达。 　　结论: 　　1.TRIM36在体外诱导食管癌细胞滞留在G0/G1期，减缓食管癌细胞的增殖，并诱导更多的食管癌细胞凋亡; 　　2.TRIM36促进人食管癌细胞β-catenin的泛素化修饰; 　　3.TRIM36在异种移植小鼠体内抑制食管癌细胞增殖并促进食管癌细胞凋亡; 　　4.在食管癌患者病变组织中，TRIM36表达量下调，β-catenin表达量上调。