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miRNA--335通过RBM10调节Numb可变剪切影响子宫内膜癌细胞增殖功能的研究

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摘要子宫内膜癌是女性生殖道三大恶性肿瘤之一，起源于子宫内膜上皮，常发生于围绝经期及绝经后妇女。近年来，子宫内膜癌的发病率呈逐年上升趋势，来源于子宫内膜上皮的子宫内膜样腺癌大约占85％-90％。迄今为止，子宫内膜癌的常见治疗方法主要包括手术治疗，放化疗、激素治疗，靶向治疗等。大多数子宫内膜癌早期即可出现症状，早期诊断，采用手术为主的综合治疗预后较好。晚期或低分化子宫内膜癌发生浸润性转移、综合治疗后复发率较高，预后差。因此寻找子宫内膜癌生物标志物，研究其发生发展的分子机制具有十分重要的意义。 　　Numb正常生理条件下能够调节细胞分化，其在恶性肿瘤中的作用也已有报道，但在不同类型的癌症中其所发挥的作用有所不同。Numb被证明可以抑制前列腺肿瘤异种移植物的生长和去势抵抗性前列腺癌的发展，其涉及与信号传导相关的各种功能(如调节Notch激活和TP53激活途径)，乳腺癌患者中Numb水平较低与预后不良相关。然而，在胶质瘤体外实验中，Numb过表达不能抑制肿瘤细胞增殖，这可能与Numb的可变剪切(alternative splicing，AS)有关。 　　可变剪切(AS)是一个前mRNA产生多个可能处于不同转录后调控下的mRNA异构体或编码不同功能的蛋白质。最近的大规模平行RNA测序(RNA-seq)转录组分析表明，人类基因经历可变剪切的可能在90％以上。在人类细胞中，可变剪切由剪切体完成，剪切体是由4个核糖核蛋白颗粒组成的动态酶复合物。可变剪切系统的组成和过程在不同的发育阶段被严格调控，其失调与包括癌症在内的各种人类疾病密切相关。通常情况下，可变剪切模式是组织和发育阶段所特有，受到新生转录本中反式RNA结合蛋白(RBPs)和顺式调控元件之间协同作用的精确调控。 　　Numb基因可变剪切主要产生两种亚型的转录本，即Numb-L和Numb-S，对应翻译为两种Numb蛋白亚型，主要区别是富含脯氨酸区域(PRR)的长度。这两种蛋白亚型在调节细胞功能方面发挥相反的作用。Numb-L可促进小鼠胚胎癌细胞增殖，但是不促进分化，Numb-S可以促进分化，但不促进增殖。据报道，Numb-L在肺癌、膀胱癌、乳腺癌和结肠癌中表达增加。有研究报道，在子宫内膜癌组织中Numb呈现高表达，然而关于Numb可变剪切产物Numb-L和Numb-S在子宫内膜癌中的表达情况尚无相关研究。 　　剪切调控因子的突变和RNA靶标的异常剪切与许多人类疾病有关。然而，到目前为止，在生理和病理条件下控制可变剪切过程的确切分子机制尚不清楚。RBM10编码一个930个氨基酸的蛋白质，包含两个RNA识别基序(RRM)、两个锌指和一个G补丁基序。这些基序通常存在于参与前mRNA剪切的RNA结合蛋白中，如异质性核糖核蛋白(HnRNPs)和小核核糖核蛋白(SnRNPs)的蛋白质组分。通过质谱分析，已有报道RBM10与纯化的剪接复合物结合，并进一步被鉴定为U2snRNPs、剪接体A(或前剪接体)和B复合物的一个成分。此外，基于酵母双杂交方法，一项对剪接体中已知的200多种蛋白质之间相互作用的研究，证明RBM10与多种剪切体成分之间的相互作用。尽管所有这些观察都提示RBM10在mRNA前剪切调控中的潜在作用，但目前还不清楚RBM10是否参与剪切以及如何调控剪切。 　　此外，可变剪切的调控机制有组蛋白修饰和microRNA(miRNA)，microRNA是一类参与基因转录后调控的非编码小分子RNA，它们通过转录后结合靶基因的3‘-非翻译区(UTR)来抑制其翻译，从而调节不同的生物学过程。本研究就可变剪切调节因子RBM更容易受到miRNA的调控为研究目的，致力于在子宫内膜癌中检测Numb可变剪切的表达情况，研究其对子宫内膜癌细胞增殖功能的影响，并进一步探索调节Numb可变剪切的可能机制。 　　第一部分Numb可变剪切在子宫内膜癌中的表达及功能 　　目的 　　1.验证Numb-L和Numb-S两种可变剪切体在子宫内膜癌中的表达差异; 　　2.探索Numb-L可变剪切体表达水平与子宫内膜癌临床特征的相关性; 　　3.筛选在子宫内膜癌中可以靶向调控Numb可变剪切的相关蛋白，并验证可变剪切调控因子RBM在子宫内膜癌组织中的表达;4.探索可变剪切调控因子RBM10水平与临床特征及Numb-L的相关性，并在子宫内膜癌细胞中验证Numb可变剪切受RBM10调控; 　　5.研究Numb-L和Numb-S两种可变剪切体表达水平与子宫内膜癌预后的规律。 　　材料与方法 　　1.研究纳入就诊于浙江中医药大学附属第一医院妇产科的子宫内膜癌患者，时间范围2016年1月至2019年5月，患者术前均未接受放化疗，收集子宫内膜癌的肿瘤组织及配对的癌旁正常内膜组织。最终收集上述配对标本共29例。 　　2.研究通过半定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹法检测配对子宫内膜癌及邻近非肿瘤对照组织中Numb-L、Numb-S亚型的mRNA和蛋白质水平。 　　3.收集患者临床特征数据分析不同临床特征的子宫内膜癌患者的Numb-L水平差异。 　　4.采用免疫印迹法测定可变剪切的三种相关蛋白RBM5、RBM6和RBM10和Numb下游基因Notch1的表达水平。 　　5.收集患者临床特征数据分析不同临床特征子宫内膜癌患者的可变剪切相关蛋白RBM10表达水平的差异，并分析Numb-L和RBM10相关性。 　　6.通过构建敲低或过表达RBM10的HEC-1A和RL95-2稳定细胞系，采用免疫印迹法测定RBM10对Numb-L和Numb-S表达的影响。 　　7.通过构建过表达Numb-L和Numb-S的HEC-1A和RL95-2稳定细胞系，采用MTT分析和平板克隆实验测定细胞增殖活力差异，半定量聚合酶链反应(PCR)检测Notch通路的靶分子HES1和HEY2的mRNA水平。 　　结果 　　1.Numb-LmRNA和蛋白表达水平在子宫内膜癌组织中均显著高于癌旁正常内膜组织，然而Numb-SmRNA和蛋白表达水平无明显差异。 　　2.子宫内膜癌患者中，Numb-L水平越高，淋巴结转移越多和FIGO分期越高。 　　3.子宫内膜癌组织中可变剪切的三种相关蛋白中仅RBM10蛋白表达水平存在差异，其表达水平发生降低，RBM5和RBM6蛋白表达水平无明显差异。 　　4.子宫内膜癌患者中，RBM10水平越低，淋巴结转移越多和FIGO分期越高，且与Numb-L水平呈负相关关系。 　　5.过表达RBM10的HEC-1A和RL95-2细胞Numb-L蛋白表达下降，Numb-S蛋白表达升高，RBM10敲低后则相反，Numb-L蛋白表达升高，Numb-S蛋白表达降低。 　　6.过表达Numb-L的HEC-1A和RL95-2细胞增殖活力升高，过表达Numb-S的HEC-1A和RL95-2细胞增殖活力发生下降。 　　7.子宫内膜癌组织中Notch1蛋白表达显著高于癌旁正常内膜组织。 　　8.过表达Numb-L的HEC-1A和RL95-2细胞中，Notch1靶基因HES1和HEY2mRNA表达升高，而过表达Numb-S的HEC-1A和RL95-2细胞中，HES1和HEY2mRNA表达降低。 　　结论 　　1.Numb-L在子宫内膜癌组织中表达异常，且与肿瘤的恶性程度相关，过表达Numb-L的子宫内膜癌细胞增殖活力升高，其可能机制是通过激活Notch信号通路。 　　2.RBM10在子宫内膜癌组织中表达异常，且与肿瘤恶性程度相关，子宫内膜癌细胞中RBM10的表达与Numb-L的表达呈负相关。 　　3.Numb-L的表达可能受可变剪切相关蛋白RBM10的调节，RBM10与Numb可变剪切之间的关系，可能为子宫内膜癌的诊断和治疗提供新的生物学标志。 　　第二部分miR-335通过RBM10调节Numb的可变剪切 　　目的 　　1.验证可变剪切相关蛋白RBM10与microRNA的转录后调控关系; 　　2.筛选靶向作用于RBM10的miRNA; 　　3.验证子宫内膜癌组织中筛选出miR-335及RBM10表达水平的相关性，及其与患者临床特征的相关性;4.研究裸鼠模型miR-335对子宫内膜癌细胞增殖功能的影响; 　　5.探索miR-335通过RBM10调节Numb的可变剪切对子宫内膜癌细胞增殖功能影响的相关机制。 　　材料与方法 　　1.同第一部分，收集子宫内膜癌组织及配对的正常癌旁内膜组织患者标本共29例。 　　2.通过半定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹法检测配对子宫内膜癌及邻近非肿瘤对照组织中RBM10的mRNA和蛋白质水平。 　　3.利用生物信息学工具预测靶向作用于RBM10的miRNAs，并通过双荧光素酶报告基因方法分析和免疫印迹证实它们与RBM10的相互作用关系，通过分析miRNAs水平与RBM10的相关性进一步筛选靶向miRNA。 　　4.筛选靶向作用于可变剪切蛋白RBM10的miRNA---miRNA-335，分析子宫内膜癌不同临床特征与miR-335表达水平的相关性，并通过Kaplan-MeierPlotter在线工具分析RBM10和miR-335与子宫内膜癌患者预后的相关性。 　　5.将miR-335过表达HEC-1A及其空白对照HEC-1A种植于裸鼠皮下，观察肿瘤生长并计算肿瘤体积，通过PCR法检测miR-335的表达水平，免疫印迹法检测裸鼠肿瘤组织中RBM10和Numb可变剪切的蛋白表达情况。 　　结果 　　1.与癌旁正常内膜组织相比，子宫内膜癌组织中RBM10蛋白水平明显降低，水平越低患者预后越差，但其mRNA水平无显著变化。 　　2.生物信息学工具筛选出靶向作用于RBM10的miRNA包括miR-22、miR-29a、miR-29b、miR-122、miR-133a、miR-133b、miR-179、miR-335、miR-382。 　　3.经荧光素酶报告基因分析显示，上述筛选出的miRNA构建报告基因质粒与RBM10共转染后荧光素酶活性受到显著抑制的是miR-133a、miR-133b和miR-335。 　　4.过表达miR-133a/b或miR-335的HEC-1A细胞中RBM10表达降低。在子宫内膜癌组织中miR335水平明显上调，且与RBM10蛋白水平呈负相关，但miR-133a/b水平无显著性差异，与RBM10蛋白水平之间无显著相关性。 　　5.接种过表达miRNA-335HEC-1A的裸鼠，肿瘤体积明显增加较快，与对照组差异显著，PCR证实裸鼠肿瘤组织内miR-335过表达，RBM10蛋白表达水平下降，Numb-L蛋白表达水平升高。 　　结论 　　1.Numb-L的表达水平与RBM10有关，RBM10进一步受miRNA-335表达的调控。 　　2.miRNA-335可能通过在转录后水平调节RBM10，从而调控Numb的可变剪切，进而促进子宫内膜癌细胞的增殖，这也为子宫内膜癌发生发展机制研究提供了新的思路。