HDAC9在高同型半胱氨酸血症致足细胞损伤中的作用-论文-万方医学网

HDAC9在高同型半胱氨酸血症致足细胞损伤中的作用

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摘要高同型半胱氨酸血症是诱导终末期肾病发生和发展过程中的关键致病因素，可引起肾小球足细胞损伤进而造成肾脏功能受损。足细胞，参与构成肾小球滤过屏障，并且是整个肾小球组织结构中最易受损的组成部分。当足细胞受损时，足突会发生融合与消除，进一步导致足细胞的凋亡和脱落，从而产生蛋白尿。然而，目前关于hHcys诱导足细胞损伤的作用机制尚未完全得到明确，因此仍需进行深入探究。 　　近些年，表观遗传学在多种疾病中的作用日益受到人们重视，其机制主要涉及DNA甲基化、组蛋白修饰及染色质重塑等。其中，组蛋白去乙酰化酶参与组蛋白乙酰化修饰，在肾脏疾病特别是足细胞损伤中的作用越来越受到人们的广泛关注。组蛋白去乙酰化酶家族成员共有4大类，其中，Ⅰ类、Ⅱ类与Ⅳ类为Zn2+依赖型酶活性，Ⅲ类为烟酰胺腺嘌呤核苷酸(NAD+)依赖型酶活性。我们课题组前期研究发现Zn2+依赖型组蛋白去乙酰化酶HDAC4能够特异性地促进糖尿病肾病中足细胞的损伤。然而，关于HDAC家族在高同型半胱氨酸血症所致的肾脏足细胞损伤中的作用尚未报道，因此阐明其作用具有重要的研究意义。课题组前期实验结果表明HDAC9在hHcys模型小鼠中表达水平出现特异性升高，提示HDAC9可能参与高同型半胱氨酸血症致肾脏损伤的发生与发展过程。因此，本课题将重点探究HDAC9在高同型半胱氨酸血症致肾脏损伤中的作用及潜在机制。 　　研究目的 　　本课题将在体内以及体外建立高同型半胱氨酸血症模型，研究HDAC9在高同型半胱氨酸血症致肾脏足细胞损伤中的作用，以及探讨其发挥作用的分子生物学机制。 　　1.阐明HDAC9在高同型半胱氨酸血症致足细胞损伤中的作用。 　　2.探讨HDAC9在高同型半胱氨酸血症致足细胞损伤中的作用机制。 　　研究方法 　　第一部分:HDAC9在高同型半胱氨酸血症致足细胞损伤中的作用 　　1.1HDAC9对高同型半胱氨酸血症小鼠蛋白尿的影响 　　取小鼠尿液进行分析，采用ELISA法测定无叶酸饮食诱导形成高同型半胱氨酸血症中HDAC9基因的缺失或活性抑制对小鼠蛋白尿的影响。 　　1.2HDAC9对高同型半胱氨酸血症小鼠足细胞损伤的影响 　　利用过碘酸雪夫氏染色观察高同型半胱氨酸血症中HDAC9基因缺失或活性抑制的小鼠与野生型小鼠的肾小球差异，接下来，利用透射电镜对高同型半胱氨酸血症中HDAC9基因缺失或活性抑制的小鼠与野生型小鼠的肾小球基底膜厚度、足突数量以及足突融合情况进行观察。同时，利用免疫荧光染色实验研究高同型半胱氨酸血症中HDAC9基因敲除或活性抑制的小鼠与野生型小鼠足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin的表达情况。 　　1.3体外探究HDAC9基因沉默对L-Hcys刺激下的足细胞损伤的作用 　　Westernblot实验检测沉默HDAC9后HPC中Nephrin、Podocin、Desmin、Vimentin、Chop以及Cleavedcaspase-12蛋白表达水平的变化，同时通过流式细胞术检测沉默HDAC9对足细胞凋亡情况的影响。 　　第二部分;HDAC9在高同型半胱氨酸血症致足细胞损伤中的作用机制 　　2.1检测HDAC9对足细胞中H3K9位点乙酰化水平的调控 　　免疫荧光双染实验检测高同型半胱氨酸血症小鼠HDAC9基因敲除后足细胞中H3K9位点乙酰化水平的变化。在使用L-hHcys处理HPC构建的体外模型中，采用Westernblot检测HDAC9基因的沉默对H3K9位点乙酰化水平的影响。 　　2.2研究HDAC9对足细胞中Klotho表达水平的调控 　　免疫荧光双染实验在体内水平检测高同型半胱氨酸血症小鼠HDAC9基因敲除后足细胞中Klotho蛋白水平的表达变化。Westernblot检测L-Hcys处理的足细胞中HDAC9基因的沉默对Klotho蛋白水平的影响。Real-timePCR实验检测L-Hcys处理的足细胞中HDAC9基因的沉默对Klotho的mRNA表达水平的调控。 　　2.3探究HDAC9能否调控H3K9位点乙酰化水平进而影响Klotho转录 　　染色质免疫沉淀方法检测Klotho启动子区域与H3K9ac是否存在结合，同时观察HPC中沉默HDAC9后对L-Hcys刺激下Klotho启动子区域H3K9位点乙酰化水平的调控。 　　2.4检测Klotho对L-Hcys诱导的足细胞损伤的作用 　　利用Westernblot实验检测足细胞中Klotho对L-Hcys诱导的足细胞损伤的作用，同时采用流式细胞术探究Klotho对L-Hcys刺激条件下的足细胞凋亡情况的影响。 　　2.5探究Klotho信号通路是否参与HDAC9介导的足细胞损伤 　　Westernblot实验检测HDAC9沉默后对于HPC中L-Hcys诱导的Nephrin、Podocin、Desmin、Vimentin、Chop以及Cleavedcaspase-12表达水平的变化，再观察沉默Klotho后以上蛋白表达变化情况。同时通过流式细胞术检测沉默Klotho对HDAC9基因沉默后对于L-Hcys诱导的足细胞凋亡情况的影响。 　　研究结果 　　第一部分:HDAC9在高同型半胱氨酸血症致足细胞损伤中的作用 　　1.1敲除HDAC9能降低高同型半胱氨酸血症小鼠的蛋白尿水平 　　ELISA结果显示，在无叶酸饮食喂养小鼠后，小鼠的尿白蛋白肌酐的比值有所升高，在HDAC9基因敲除后，高同型半胱氨酸血症小鼠中的尿白蛋白肌酐的比值较野生型小鼠出现明显降低。使用HDAC9的非特异性抑制剂丙戊酸钠对小鼠进行体内给药，结果发现小鼠的蛋白尿水平也有明显降低。 　　1.2敲除HDAC9改善高同型半胱氨酸血症小鼠足细胞损伤 　　PAS结果表明，高同型半胱氨酸血症小鼠的肾小球系膜增生加重。TEM也表明，高同型半胱氨酸血症小鼠中出现肾小球基底膜的增厚、足突的融合以及足突数量的减少，而以上特征在HDAC9基因敲除或抑制后有所恢复。IF发现高同型半胱氨酸血症小鼠模型中，足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin的表达水平下降，在HDAC9基因敲除或抑制后其表达水平又有所恢复。 　　1.3HDAC9对L-Hcys刺激下的足细胞损伤具有改善作用 　　WB检测结果表明，足细胞中沉默HDAC9能够抑制L-Hcys诱导的足细胞内功能性蛋白Nephrin、Podocin、Desmin、Vimentin、Chop以及Cleavedcaspase-12的表达水平的变化，另外，流式细胞术观察结果表明，沉默HDAC9能够减少L-Hcys诱导的足细胞的凋亡。 　　第二部分:HDAC9在高同型半胱氨酸血症致足细胞损伤中的作用机制 　　2.1敲除HDAC9可上调足细胞H3K9位点乙酰化水平 　　免疫荧光双染实验检测结果发现，HDAC9基因敲除能够恢复高同型半胱氨酸血症足细胞中H3K9ac的表达水平。同时，HPC中沉默HDAC9后，L-Hcys所诱导的H3K9ac的表达水平的降低也在一定程度上被逆转。 　　2.2HDAC9反向调控足细胞中Klotho的表达水平 　　免疫荧光双染实验检测结果发现，HDAC9基因敲除能够恢复高同型半胱氨酸血症足细胞中Klotho的表达水平。RT-PCR检测发现HDAC9基因的沉默能够恢复在L-hHcys刺激条件下Klotho的表达水平的降低，体外Westernblot实验检测结果显示足细胞中沉默HDAC9能逆转L-Hcys刺激条件下Klotho水平的降低。表明HDAC9能够反向调控Klotho的表达水平。 　　2.3HDAC9通过调控足细胞中H3K9位点乙酰化水平抑制Klotho的转录 　　CHIP结果表明Klotho启动子区域与H3K9ac存在结合，并且L-Hcys刺激条件下Klotho启动子区域H3K9位点乙酰化水平明显降低，沉默HDAC9后H3K9位点乙酰化水平又有所升高。 　　2.4Klotho能够改善L-Hcys诱导的足细胞损伤 　　Westernblot实验检测结果显示Klotho能够在一定程度上逆转hHcys所诱导的Nephrin、Podocin蛋白水平的下调，同时也能够逆转hHcys所诱导的Desmin、Chop、Cleavedcaspase12蛋白表达水平的升高。细胞流式检测结果表明hHcys可以诱导足细胞凋亡，加入Klotho可以显著抑制L-Hcys诱导的足细胞凋亡，表明Klotho能够改善L-Hcys诱导的足细胞损伤。 　　2.5Klotho信号通路参与HDAC9介导的足细胞损伤 　　Westernblot实验发现沉默HDAC9可以减少L-Hcys诱导的肾脏组织中Nephrin、Podocin蛋白表达水平的下调并且能够明显减少Desmin的蛋白表达水平，再沉默Klotho后Nephrin、Podocin及Desmin的表达又有所恢复。流式细胞术检测后发现L-hHcys诱导足细胞凋亡，沉默HDAC9后能够减少L-Hcys诱导的足细胞凋亡，再沉默Klotho后发现足细胞凋亡又有所增多，表明HDAC9能够调控Klotho信号通路参与L-Hcys所诱导的肾脏足细胞损伤。 　　结论与创新性 　　1.在HDAC9在高同型半胱氨酸血症所诱导的足细胞损伤的作用研究中，我们发现HDAC9基因缺失能够改善足细胞的损伤。 　　2.在HDAC9在高同型半胱氨酸血症所诱导的足细胞损伤作用机制研究中，我们发现HDAC9通过降低H3K9位点的乙酰化水平，抑制Klotho基因的转录激活，继而在足细胞损伤中发挥作用。 　　3.课题组首次证明HDAC9可以靶向调控Klotho信号通路在足细胞损伤中起到重要作用，这为HDAC9下游的作用与机制研究提供了新思路，同时也为HDAC9作为肾脏相关疾病的治疗靶点提供了一定的科学理论基础。