检索历史 清除

摘要乳腺癌的发生率位居女性恶性肿瘤之首，严重威胁女性的生命健康。三阴性乳腺癌（ER、PR及HER-2阴性）约占全部乳腺癌病例的15％，具有恶性程度高、侵袭性强且复发率高的特点，患者生存率较低，主要以化疗、手术治疗为主。新辅助化疗是局部晚期乳腺癌患者的标准疗法之一。三阴性乳腺癌患者的新辅助化疗方案以蒽环类化疗药物和紫杉醇类化疗药物为基础，常用的含蒽环类药物方案包括阿霉素/多柔比星（Adriamycin），环磷酰胺（Cyclophosphamide），氟尿嘧啶(Fluorouracial，FU)等。接受化疗的三阴性乳腺癌患者容易产生化疗耐药，其中的分子机制尚不明确。<br>　　Cohesin是高度保守的、大的环状蛋白质复合物，主要由四个亚基组成（SMC1A、SMC3、RAD21和STAG1/2）。作为核心亚基的RAD21是SMC1/SMC3异二聚体和STAG亚基之间唯一的物理连接，能够调节Cohesin与染色质的结合或解离，参与维持细胞基因组稳定性和调控基因的转录表达。RAD21是导致乳腺癌发生的癌症驱动基因之一，RAD21的基因扩增或过度表达，与乳腺癌的进展、预后差及化疗耐药有关。虽然已有多项研究提示RAD21与肿瘤化疗耐药有关，但是RAD21参与调控肿瘤化疗耐药的分子机制目前尚不明确。<br>　　目的:<br>　　探讨RAD21参与调控三阴性乳腺癌阿霉素和5-FU化疗敏感性的分子机制，为乳腺癌的早期诊断、新辅助化疗反应疗效标志物的鉴定和个性化治疗提供新的科学依据。<br>　　方法:<br>　　利用流式细胞术检测敲低RAD21对三阴性乳腺癌细胞内活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平的影响;利用Western Blotting检测RAD21低表达对细胞DNA损伤的影响;通过Western Blotting、RT-qPCR和双荧光素酶活性检测等实验分析RAD21对NRF2/ABCC3通路的调控作用;利用荧光显微镜检测阿霉素的自发荧光，分析RAD21低表达对阿霉素在乳腺癌细胞内的摄入和滞留的影响;利用CCK8实验、Western Blotting分析RAD21调控三阴性乳腺癌细胞阿霉素敏感性的作用;利用EdU掺入实验分析RAD21低表达对5-FU诱导的三阴性乳腺癌细胞增殖抑制的影响;利用CCK-8、平板克隆形成实验检测RAD21调控三阴性乳腺癌细胞5-FU敏感性的作用;通过Transwell实验检测RAD21低表达对5-FU诱导的三阴性乳腺癌细胞迁移能力的影响;Western Blotting分析RAD21低表达对5-FU诱导的乳腺癌细胞ABHD5表达的影响。<br>　　结果:<br>　　1.敲低RAD21基因导致三阴性乳腺癌细胞内ROS水平和DNA损伤增加<br>　　在MDA-MB-231和BT549细胞中，敲低RAD21基因导致细胞内ROS水平升高;γ-H2AX、RAD50蛋白水平升高、RAD51蛋白水平降低，DNA损伤增加。<br>　　2.RAD21低表达激活三阴性乳腺癌细胞NRF2/ABCC3通路<br>　　在低表达RAD21基因的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，NRF2蛋白水平升高，但是mRNA水平没有升高，这表明RAD21低表达所致的NRF2蛋白累积很可能是因为ROS水平升高引起NRF2蛋白稳定性增加所致。乳腺癌细胞RAD21低表达促进NRF2的转录活性，NRF2部分下游靶基因如ABCC3、FTH1表达升高，而GSTP1、ABCG2的表达水平未改变。三阴性乳腺癌细胞中RAD21低表达可能是选择性激活了NRF2-ABCC3和NRF2-FTH1通路。<br>　　3.低表达RAD21通过激活NRF2/ABCC3通路降低了三阴性乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性<br>　　经0.5μM阿霉素作用不同时间后，在MDA-MB-231、BT549细胞中RAD21蛋白水平明显降低，而NRF2、ABCC3蛋白水平均上调。与对照组相比，低表达RAD21基因的MDA-MB-231细胞对阿霉素的敏感性降低;而在过表达RAD21基因的MDA-MB-231细胞中，与对照组相比，其对阿霉素的敏感性增加。敲低RAD21基因的乳腺癌细胞经阿霉素作用后，细胞凋亡相关分子标记物cleaved-caspase3蛋白水平显著减少，表明敲低RAD21抑制了阿霉素诱导的细胞凋亡。由于RAD21低表达的MDA-MB-231细胞中ABCC3蛋白水平升高，引起乳腺癌细胞对阿霉素的摄入减慢、外排增加，细胞凋亡减少和细胞存活率增加，最终导致细胞对阿霉素的敏感性降低。拯救实验结果显示在乳腺癌细胞中NRF2特异性抑制剂ML-385可以逆转低表达RAD21引起的阿霉素外排增加。<br>　　4.低表达RAD21增加三阴性乳腺癌细胞对5-FU的敏感性<br>　　在低表达RAD21基因的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，与对照组细胞相比，敲低组细胞对5-FU的敏感性增加;细胞增殖能力降低;细胞迁移能力降低。<br>　　我们检测发现MDA-MB-231细胞、BT549细胞经5-FU作用后DPYD、UCK1和TYMP的蛋白水平均明显降低。此外，5-FU作用后RAD21低表达三阴性乳腺癌细胞及对照细胞的DPYD和UCK1蛋白的表达水平也都下降，并且在对照组和敲低组之间没有差异。RAD21调控的三阴性乳腺癌细胞5-FU敏感性可能并不依赖DPYD和UCK1蛋白。<br>　　5.低表达RAD21可能通过抑制ABHD5的表达上调，进而促进三阴性乳腺癌细胞对5-FU的利用<br>　　MDA-MB-231细胞、BT549细胞经5-FU作用后ABHD5的蛋白和mRNA水平显著升高，并且呈药物浓度依赖性和时间依赖性。<br>　　在MDA-MB-231细胞中敲低RAD21基因后，ABHD5的mRNA水平和蛋白水平没有明显变化。与对照组细胞相比，在低表达RAD21基因的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，经5-FU作用后ABHD5的蛋白水平并没有升高。<br>　　结论:<br>　　1.RAD21参与维持细胞内ROS稳态和基因组完整性;<br>　　2.RAD21负调控NRF2/ABCC3通路增加三阴性乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性;<br>　　3.RAD21可能通过调控ABHD5降低三阴性乳腺癌细胞对5-FU的敏感性。