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摘要背景:<br>　　结核性脑膜炎(Tuberculous meningitis，TBM)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的中枢神经系统感染性疾病，表现为结核性炎症、脑水肿、脑积水等引发的脑膜刺激症和发热、头痛等结核中毒症状群，具有致死率和致残率高等特点。荟萃分析显示，TBM的死亡风险为24.7％，成人晚期艾滋病(HIV)患者中死亡率超过50％，幸存者神经系统后遗症风险高达51％。近年来因为人口流动、HIV发病率增加及耐药性结核病例增加等因素影响，结核性脑膜炎发病率呈升高趋势，因为其临床表现不典型，早期诊断困难，误诊率高，重症患者致死率和致残率仍处于较高水平。早期诊断，联合应用易透过血脑屏障的抗结核药物，积极有效的处理颅内高压，以减少后遗症和防止复发，是TBM的主要治疗原则。临床上，多数TBM患者起病缓慢，偶见急性起病，正确诊断取决于对结核性脑膜炎病理生理过程和特点的充分认识，对其临床表现、实验室和影像学检查的正确评价，以及对中枢神经系统以外结核病灶的取证。因为亚临床感染的广泛存在，结核菌素试验对成年人诊断意义不大，脑脊液细胞计数、葡萄糖水平、氯化物水平和蛋白质水平等通常与其他脑膜炎相似。此外不合理或不恰当的治疗使患者临床表现和脑脊液改变不典型，从而增加了诊断难度。考虑到TBM的诊断方法尚不完善，TBM早期诊断需要新的技术或方法。<br>　　TBM诊断困难的主要原因是症状和体征的非特异性，而作为重要诊断标本的脑脊液中结核菌数量非常少，难以早期鉴别诊断。发热、头痛、呕吐、精神状态改变和脑膜刺激征是TBM患者最常见的初始症状，但这些症状在多种疾病中可以出现，缺乏疾病特异性。WHO推荐四联方案治疗TBM，但治疗TBM的抗结核药物透过血-脑脊液屏障能力不同和杀死MTB的能力存在差异，患者个体化的脑膜炎炎症反应及重症患者比如脑积水、脑结核瘤等病变的压迫效应同样存在明显差异，所以TBM的预后个体间差异很大，需要深入了解TBM的病理生理学、临床特征等因素。4岁以下儿童、老年人群及艾滋病人等免疫力低下者是TBM的易感人群，多项研究对儿童TBM、HIV合并TBM、老年TBM临床特征进行了深入研究，在改善相应类型TBM诊断水平和治疗策略的方面发挥了积极作用。尽管TBM通常被认为是HIV患者的机会性感染，但在免疫功能正常的HIV阴性个体中也可以观察到TBM发病。国外研究显示，皮质类固醇的长期大量应用、肝胆脏器疾病等是TBM的常见因素，但部分患者没有合并基础疾病，也会患TBM。中青年人群是TBM患者的重要组成部分，但目前较少见对该群体TBM患者临床特征及长期预后影响因素的报道。<br>　　耐药性的出现对全世界结核病的控制提出了紧迫的挑战，2018年，全球估计有500000例结核病病例(在1000万例结核病病例中)对利福平耐药，利福平是一线抗结核治疗的关键药物之一，一旦耐药，就需要应用昂贵的二线抗结核药物，耐药患者治疗时间延长，治疗时出现的毒副反应增加，平均治疗成功率只有56％。尽管近年来在开发抗TB的简化预防方案方面取得了显著进展，但由于目前没有检测潜伏性结核感染(LTBI)的方法来确定感染菌株的药物敏感性，因此抗TB感染的预防性治疗变得复杂。2016年至2017年，在30个耐多药结核病高负担国家中，有6个国家报告的耐多药结核病病例数增加了30％以上。2018年全世界估计有48.4万例耐多药/利福平耐药结核病(MDR/RR-TB)的发病病例。2019年，全球3.3％的新发结核病病例和17.7％的先前治疗病例是MDR-TB，在中国，7.1％的新病例和23％的先前治疗病例属于MDR-TB，超过了全球平均水平。一些研究表明，最近耐多药结核病菌株和广泛耐药菌株的传播已变得越来越严重，传播模式占主导地位，不仅仅是抗生素使用不当引起耐药性的出现，这突出了DR-TB防治的重要性。正如来自不同国家的研究人员的共识，控制DR-TB的流行对全球结核病控制和公共卫生起着至关重要的作用。国外研究显示，2017年耐多药结核病的平均成本为7141美元，几乎是药物敏感结核病的6倍，给患者和医务工作者造成了巨大的损失。随着结核病治疗从标准化治疗转向个体化治疗，有关人群耐药模式的信息变得越来越重要。在我国结核病高发的背景下，重视结核杆菌的耐药特点，为临床合理用药提供决策依据是非常重要的。随着耐药及耐多药结核病的流行，耐药性TBM患者逐渐增多，严重影响了结核性脑膜炎患者的预后。在耐药性结核性脑膜炎患者的治疗中，早期诊断、经验性治疗、调整治疗方案对患者的预后尤为重要，发现耐药TBM患者的早期临床特征，可能为耐药结核性脑膜炎的诊断和及时治疗提供依据。<br>　　目前TBM诊断的金标准是脑脊液中检测到MTB，但是脑脊液涂片抗酸染色的阳性率仅为10％，而脑脊液MTB培养耗费时间较长，通常需要2周以上时间，而且培养的阳性率只有20％～30％，对于临床的早期诊断价值有限。近年来出现了多种新的结核病的诊断技术，其中分子诊断技术是近几年的重要突破，其代表即XpertMTB/RIF方法。但无论是传统的脑脊液MTB培养法还是新的XpertMTB/RIF检测法，其诊断结核性脑膜炎的敏感度仍然很低。<br>　　随着现代科学技术的发展，高通量测序(High-throughput sequencing)已经成功应用于肿瘤、糖尿病、产前诊断、临床病原体检测等领域，二代测序(next-generation sequencing，NGS)是一种新兴的高通量测序方法，可以快速的对DNA或RNA样本的碱基进行测序，该技术目前已被报道用于细菌、真菌和病毒等多种病原体的诊断，尤其是该技术已被报道用于中枢神经系统感染的诊断，然而，该技术对于TBM的诊断价值尚未明确。<br>　　目的:<br>　　第一部分:探讨中青年TBM患者的临床特点及影响其长期不良预后的风险因素。<br>　　第二部分:探讨耐药TBM患者的临床特征及分析产生耐药的危险因素。<br>　　第三部分:评价二代测序技术对于TBM患者的早期诊断价值。<br>　　方法;<br>　　第一部分:收集山东省胸科医院2009年1月至2013年12月间住院治疗的中青年TBM患者资料进行回顾性分析，记录患者的临床资料，分析其随访5年时功能预后。首先根据预后对临床资料进行卡方检验或t检验，对其中有统计意义(P＜0.05)的变量赋值(连续变量或定义变量)，然后经单因素与多因素logistic回归分析影响患者长期不良预后的独立危险因素。<br>　　第二部分:收集2009年1月至2016年12月期间住院治疗的培养阳性结核性脑膜炎患者资料进行回顾性研究，收集患者的临床、实验室数据和人口统计学特征。为了确定耐药结核性脑膜炎的临床特征并找到可能导致耐药的危险因素，我们采用了单变量比较和多变量逻辑回归分析。<br>　　第三部分:前瞻性纳入2018年2月至2018年8月于山东省胸科医院就诊的临床怀疑结核性脑膜炎的患者共50例，并跟踪随访其诊疗结局。送检脑脊液标本均进行二代测序，测序所得原始序列与病原微生物数据库进行对比得到最终结果。二代测序结果以检测到结核分枝杆菌复合群唯一比对序列为阳性，未检测到唯一比对序列为阴性。以符合脑脊液结核菌培养阳性、涂片阳性、XpertMTB/RIF检测阳性及结核分枝杆菌核酸检测阳性等4项中至少1项即为确诊结核性脑膜炎患者;临床可疑结核性脑膜炎且抗结核治疗有效为临床诊断患者;有其他病原学依据或临床排除结核性脑膜炎者为非结核性脑膜炎患者。分析二代测序在结核性脑膜炎早期诊断中的敏感性和特异度。<br>　　结果:<br>　　第一部分:本研究共筛选600例患者，其中男339例，女261例，平均年龄(36±19)岁;预后不良率42.17％(253/600例)。单因素分析显示不同预后患者年龄(t=-3.723，P＜0.05)、分期(Z=-4.789，P=0.000)、意识改变(x2=10.198，P=0.001)、认知功能障碍(x2=7.813，P=0.000)、颅神经麻痹(x2=5.911，P=0.041)、外周神经功能异常(x2=14.179，P=0.017)、脑膜刺激征(x2=6.951，P=0.008)、脑脊液蛋白含量(Z=-4.835，P=0.015)、脑积水(x2=11.564，P=0.001)、脑梗死(x2=7.142，P=0.017)、耐药结核(x2=0.217，P=0.004)存在统计学差异。多因素logistic回归分析显示患者年龄[OR1.059，95％CI1.025，1.087)，P=O.000]、意识改变[OR=3.545，95％CI(1.069，10.685)，P=0.037]、MRCⅢ期[OR=23.985，95％CI(3.878, 40.129),P=0.000]、脑积水[OR=2.917,95％CI(1.049, 8.613),P=0.023]、脑梗死[OR=3.178，95％CI(0.981，8.173)，P=0.019]、耐药结核[OR=11.672，95％CI(1.681，30.112)，P=0.001]与是导致预后不良的风险因素。<br>　　第二部分:本研究共筛选164例结核菌培养阳性患者，其中耐药结核性脑膜炎41例(25％)。耐药结核性脑膜炎比药物敏感结核性脑膜炎有更高的死亡率(46.3％vs8.9％，P＜0.001)。住院时间(OR 1.059，95％CI 1.025，1087)、呕吐(OR 3.545, 95％CI 1.069, 10.685)、脑脊液ADA(OR 3.178, 95％CI 0.981, 8.173)、脑脊液中性粒细胞学占优势(OR 11.672，95％CI 1.681，30.112)、既往结核病史(OR 23.985，95％CI 3.878，40.129)、合并其他脏器结核(OR 8.161，95％CI 1.235，11.269)、年龄(OR 5.471，95％CI 1.051，8.954)、性别(OR 5.471，95％CI 1.051，8.954)、脑压(OR 2.917，95％CI 1.049，8.613)为耐药结核性脑膜炎的独立危险因素。<br>　　第三部分:确诊为结核性脑膜炎患者22例中XpertMTB/RIF检测阳性13例，培养阳性6例，结核核酸PCR检测阳性5例，临床诊断为结核性脑膜炎患者12例，非结核性脑膜炎患者16例。在确诊及临床诊断患者中，二代测序技术检测到结核分枝杆菌复合群系列20例，敏感度为58.8％(20/34)，特异度为100％(16/16)。在确诊患者中，二代测序的敏感度为63.6％(14/22);在同步进行结核分枝菌培养、XpertMTB/RIF检测与二代测序的50例标本中，以临床诊断为标准，3种方法的特异度均为100％(16/16);传统方法、XpertMTB/RIF检测及二代测序的敏感度分别为29.4％(10/34)、38.2(13/24)和58.8(20/34)，传统检测方法与二代测序敏感度差异有统计学意义(McNemar检验:x2=8.333、P=0.013)，XpertMTB/RIF检测及二代测序比较(x2=8.333、P=0.065)，差异性无显著性。传统方法与二代测序联合检测的敏感度高达82.4％(28/34)。<br>　　结论:<br>　　第一部分:年龄、MRCⅢ期、意识改变、脑积水、脑梗死、耐药结核是结核性脑膜炎长期不良预后的独立危险因素。<br>　　第二部分:耐药结核性脑膜炎比药物敏感性结核性脑膜炎的死亡风险更高，预后更差，男性、未婚、住院时间、呕吐、脑脊液ADA、脑脊液中性粒细胞数占优势、既往结核病史、合并其他脏器结核为耐药结核性脑膜炎的独立危险因素。<br>　　第三部分:二代测序技术能够较快速地检测脑脊液中的结核分枝杆菌复合群，且其敏感性和特异度均较显著，可作为结核性脑膜炎的早期诊断指标。二代测序联合传统检测方法可提高检出率。