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摘要肿瘤发生发展与肿瘤组织中驻留和招募的免疫细胞之间的关系已在临床上获得广泛关注。肿瘤浸润B细胞(tumor infiltrating B cells，TIB)是肿瘤组织中最重要的免疫细胞之一，常见于乳腺癌和黑色素瘤等各种实体肿瘤，在肿瘤微环境中发挥免疫调节作用。研究表明，TIB分泌抑制性因子:TGF-β、IL-10等;增加T辅助细胞向抑制性Th2极化，抑制Thl细胞;抑制CD4+和CD8+T细胞;或促进调节性T细胞(regulatoryT cells，Treg)增殖，抑制抗肿瘤免疫。作为肿瘤微环境的重要调控细胞，TIB与肿瘤发展间的关系不容忽视，其免疫抑制将影响肿瘤治疗效果，这意味着TIB免疫疗法可通过对免疫微环境的系统性调节提高治疗效果。<br>　　依鲁替尼(Ibrutinib，Ib)是首个获批上市用于B细胞相关淋巴瘤和血液病的小分子药物，通过与酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase，BTK)半胱氨酸残基结合，使B细胞受体通路中BTK下游信号被阻断，从而起到耗竭B细胞的作用。依鲁替尼在结直肠癌、胰腺导管腺癌等实体肿瘤的临床前研究以及数项Ⅰ/Ⅱ早期临床试验的开展中显示出良好的效果。利用依鲁替尼抑制肿瘤组织中BTK活化，耗竭TIB，从而阻断其免疫抑制作用，重塑肿瘤免疫微环境。多西他赛(Docetaxel，DTX)通过加强微管蛋白聚合和抑制微管解聚，直接杀伤肿瘤细胞，已广泛应用于黑色素瘤等的临床治疗。因此，本文提出结合化学治疗和TIB耗竭的肿瘤免疫化学治疗新策略，联用依鲁替尼和多西他赛，通过耗竭TIB阻断其免疫抑制作用，有效地重塑黑色素瘤的免疫微环境，调节抗肿瘤免疫应答并杀死肿瘤细胞，化学免疫联合治疗增强抗肿瘤作用。<br>　　由于依鲁替尼作用于TIB，多西他赛作用于肿瘤细胞，因此需将二者分别递送至其靶细胞。理想的递送载体应增加异靶点药物在肿瘤中的共定位，并将每种药物选择性地分别递送至其靶向的免疫细胞和肿瘤细胞，促进细胞摄取，增加协同抗肿瘤作用。因此，本文设计了一种由生物大分子外壳和异靶点脂质纳米粒内核组成的重塑肿瘤微环境杂合纳米笼，以共同递送依鲁替尼和多西他赛到达肿瘤组织，并分别靶向TIB和肿瘤细胞，实现异靶点药物递送，增强化疗免疫联合治疗效果。<br>　　本文分别合成可与TIB表面CD22受体特异性结合的N-乙酰神经氨酸(N-Acetylneuraminic Acid,Neu5Ac)修饰的磷脂材料，可与黑色素瘤细胞表面黑色素1受体特异性结合的Cys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val(α-MSH)修饰的磷脂材料，和可与肿瘤血管内皮细胞表面CD13受体特异性结合的天门冬酰胺酰-甘氨酸-精氨酸（asparagines-glycine-arginine，NGR）修饰的肿瘤微环境pH响应型电荷翻转材料羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan-polyethylene glyco-NGR，CMCS-PEG-NGR，CPN)。通过薄膜分散法将依鲁替尼和多西他赛分别装载至阳离子靶向脂质纳米粒中形成异靶点脂质纳米粒内核(Neu5Ac modified Ib loaded cationic lipid nanoparticles andα-MSH modified DTX loaded cationic lipid nanoparticles，NLI和MLD），并与CPN通过静电作用自组装形成杂合纳米笼(CPN-NLI/MLD)。<br>　　通过NGR介导的主动靶向，CPN-NLI/MLD可在肿瘤组织中蓄积并响应于肿瘤微酸环境，电荷翻转材料CPN发生质子化，纳米笼由负电转变为正电，通过静电斥力解聚释放异靶点脂质纳米粒，NLI表面修饰的Neu5Ac和MLD表面修饰的α-MSH分别介导纳米粒靶向TIB和肿瘤细胞，有利于增加TIB对依鲁替尼和肿瘤细胞对多西他赛的摄取。多西他赛直接杀伤肿瘤;依鲁替尼通过抑制TIB信号通路中BTK磷酸化，耗竭TIB，阻断其免疫抑制作用，重塑肿瘤免疫微环境，增强抗肿瘤免疫，继而增强化学免疫联合治疗的抗肿瘤效果。<br>　　本文主要研究内容和结果如下:<br>　　1.依鲁替尼及多西他赛含量测定方法的建立<br>　　采用高效液相色谱法分别建立Ib和DTX含量测定方法。结果表明，药物含量测定线性良好，专属性强，精密度和回收率符合要求，能够分别准确测定Ib和DTX的含量。<br>　　2.依鲁替尼和多西他赛共载重塑肿瘤微环境杂合纳米笼的制备及表征<br>　　首先分别合成了不同的靶向配体修饰的材料，为实现肿瘤组织蓄积以及肿瘤微环境pH响应性解聚，合成靶向分子NGR修饰的电荷翻转材料CPN。为实现Ib和DTX的异靶点递送，分别合成靶向分子Neu5Ac和α-MSH修饰的磷脂材料。通过薄膜分散法分别制备装载Ib和DTX的靶向脂质纳米粒NLI和MLD，通过静电吸附法制备重塑肿瘤微环境杂合纳米笼CPN-NLI/MLD。通过粒径仪和透射电镜对粒径、电位、形态和电荷翻转性能等进行评价。结果表明，CPN-NLI/MLD粒径为117.5±14.9nm，电位为-21.5±1.05mV，形态圆整。CPN-NLI/MLD在pH6.5条件下粒径由121.2±16.2nm转变为49.4±4.9nm，电位由-8.1±1.2mV翻转为2.4±0.3mV。Ib和DTX在pH6.5下的累积释放率分别为58.0％和54.9％，显著高于pH7.4条件（43.3％和36.3％）(p＜0.001，p＜0.001)，表明CPN-NLI/MLD在肿瘤微环境条件下能响应性解聚。<br>　　3.依鲁替尼和多西他赛共载重塑肿瘤微环境杂合纳米笼的逐级靶向递送行为评价<br>　　选择黑色素瘤为肿瘤模型，考察CPN-NLI/MLD的主动靶向和异靶点递送能力。细胞摄取和小动物成像实验中，CPN-NLI/MLD可在NGR介导下主动靶向肿瘤组织。细胞摄取实验中，Ib和DTX能够分别被TIB和肿瘤细胞摄取，且在pH6.5下的摄取量较pH7.4明显增加(p＜0.05，p＜0.05)。细胞共培养实验中，CPN-NLI/MLD与混合游离药物相比具有良好的异靶点递送能力，能将两种药物分别递送至靶细胞。这些结果表明，CPN-NLI/MLD在肿瘤微环境响应性解聚后，NLI和MLD可以分别靶向TIB和肿瘤细胞，发挥联合治疗作用。<br>　　4.依鲁替尼和多西他赛共载重塑肿瘤微环境杂合纳米笼的药效学与安全性评价<br>　　通过细胞毒性实验、Western-blot等分别考察CPN-NLI/MLD对B16和WEHI231的细胞毒性作用。结果表明，CPN-NLI可降低WEHI231中磷酸化BTK(retinoblastoma BTK，p-BTK)水平，相较于游离Ib具有较高的细胞毒性(p＜0.05);CPN-MLD相较于游离DTX对B16细胞具有较高的细胞毒性(p＜0.01)。免疫学评价中，CPN-NLI/MLD能有效抑制肿瘤组织中BTK磷酸化，减少TIB，降低Treg比例，促进CD4+和CD8+T细胞浸润，提高免疫激活因子IFN-γ和IL-2的水平，降低免疫抑制因子IL-4、IL-10和TGF-β的水平，并提高M1/M2型肿瘤相关巨噬细胞比例，增加树突状细胞和自然杀伤细胞的数量，重塑免疫微环境，增强抗肿瘤免疫。体内抑瘤实验中CPN-NLI/MLD组小鼠瘤重较CPN-NLI和CPN-MLD组显著降低(p＜0.001，p＜0.01)，肿瘤组织H&E、Ki67和TUNEL染色以及生存期实验结果表明其具有良好的化学免疫联合治疗作用。体内主要脏器H&E染色表明CPN-NLI/MLD初步安全性良好。<br>　　综上，本文基于耗竭TIB免疫治疗理念，构建了一种肿瘤微环境pH响应型重塑肿瘤微环境杂合纳米笼，用于逐级靶向递送依鲁替尼和多西他赛分别至TIB和肿瘤细胞。该杂合纳米笼可通过耗竭TIB，重塑肿瘤免疫微环境，提高化疗免疫联合治疗效果，为异靶点递送药物载体的先进设计和基于TIB免疫治疗的肿瘤联合治疗模式提供了有效的策略。