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摘要早发性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency，POI)指女性在40岁之前出现卵巢功能的明显衰退，临床表现为闭经或月经稀发、促性腺激素水平升高(FSH＞25IU/L)等。POI不仅导致生殖障碍，也严重影响女性的身心健康。由于卵巢功能下降的不可逆性，目前尚无有效的方法恢复或者改善卵巢功能，因此对POI患者进行早期预警、早期诊断及早期干预显得尤为重要。POI的病因包括染色体异常和基因变异、免疫、感染、放化疗和医源性损伤等，大多数患者的病因仍然不明确(即特发性POI)。遗传因素一直是POI病因研究的重点，一方面，明确的分子诊断能够提示患者的发病机制、可能的并发症及基因缺陷传递至后代的风险，有助于临床干预和健康管理;另一方面，遗传筛查也可以提示高危人群，从而实现风险预警。尽管目前已经发现了几十个POI致病基因，但已知基因变异累计起来仅能解释一小部分(＜5％)患者，意味着POI的遗传机制仍有大量的空白有待研究。POI的遗传异质性极高，每个已知致病基因仅能解释非常低的样本比例，需要结合更大的样本量来探索POI的遗传机制。因此本论文对1030例POI患者进行了全外显子组测序分析，对其遗传致病因素进行深入的探索，以期发现新的致病基因，扩大POI致病基因及突变谱，并在大样本中探索POI的遗传规律和遗传特征，为POI的分子诊断和风险预警提供指导。<br>　　在本论文的第一章中，我们对1030例特发性POI患者进行全外显子组测序(Whole exome sequencing，WES)，结合“华表”全外显子组测序项目和gnomAD公共数据库东亚人群的对照测序数据，对变异进行严格地筛选和ACMG评级，确定评级为致病和可能致病的变异(以下简称致病变异)。同时，我们详尽地收集了719个和卵巢功能相关的基因，在此基因列表的基础上进行致病变异集合分析，发现了27个基因的致病变异在POI中显著富集，其中14个基因从未在人类POI中有过报道，包括:CCDC155、CPEB1、HMMR、HSD17B1、LGR4、MCMDC2、NUP43、PPM1B、PRDM1、PTCH1、SPATA22、STRA8、ZAR1和ZP3。其中，我们对2个新基因(STRA8和MCMDC2)在本研究POI队列中发现的有害变异进行体外实验功能验证，发现它们可以引起蛋白功能受损，分别影响减数分裂启动和同源重组修复等过程，从而导致POI的发生。功能实验的结果也表明了我们变异筛选和评级方法的有效性，提示该14个新发现的候选基因是POI新的潜在致病基因。<br>　　除了发现新的POI致病基因和变异，我们进一步对POI的遗传规律进行了深入探讨。基于14个新鉴定的POI致病基因和88个已知的POI致病基因，统计这102个基因上的致病变异在POI中的贡献度及特征。我们首先对部分已知致病基因的意义不明确(Variants of uncertain significance，VUS)的变异进行功能验证，以提高这些变异的致病性评级;最终在223个POI患者中发现了231个致病变异，POI的遗传变异解释率达21.65％。我们对变异的致病方式进行分析，发现单基因杂合、双等位基因变异和多个基因杂合变异分别占78.92％(176/223)、12.56％(28/223)和8.52％(19/223)。随后对每个基因解释率的分析发现，单个基因最多在11个患者中发现致病变异(NR5A1、GALT、MCM9)，解释率不足1.2％，证实POI的高度遗传异质性。进一步按照POI患者的闭经类型分类，原发性闭经(Primary amenorrhea，PA)患者总的遗传变异解释率(25.0％ vs 20.6％)、双等位基因(6.7％ vs 2.2％)和多个杂合变异(2.5％vs 1.8％)解释率均高于继发性闭经(Secondary amenorrhea，SA)，说明PA的遗传倾向更明显。基因-表型的倾向性分析提示FSHR变异在PA患者中有明显聚集。最后，通过基因集富集分析发现减数分裂、DNA损伤修复、线粒体功能、脂肪酸代谢、激素合成、氧化还原反应等通路在POI中显著富集，提示这些通路在POI中的重要作用。<br>　　出现多个POI患者的家系强烈提示存在相同的遗传致病机制，因此在本论文的第二章中，我们对一个家族性POI的家系进行WES和遗传分析，鉴定出一个全新的POI候选基因C3orf33。该家系的患病姐妹均携带分别来自父母的C3orf33双等位基因无义突变:p.Arg85Ter(父源)和p.Glu172Ter(母源)。随后，我们在1030例散发患者中筛查C3orf33基因变异，在另一例散发患者中发现了C3orf33的纯合无义突变p.Arg85Ter。所有携带C3orf33双等位基因变异的患者均表现为PA，同时，华表和gnomAD数据库的对照数据中均未发现该基因的纯合LoF突变。以上遗传学证据均提示C3orf33可能是POI的潜在致病基因，但对该基因的功能研究尚少，与卵巢功能的相关性仍不明确。为了进一步研究C3orf33在POI中的作用，我们首先通过表达谱分析明确了C3orf33在小鼠卵巢中表达丰度较高，并在卵母细胞和颗粒细胞中均有表达。随后本论文利用CRSPR-Cas9技术构建了C3orf33基因敲除小鼠，通过对C3orf33-/-小鼠生殖表型的观察，发现C3orf33-/-小鼠的卵巢形态正常，各级卵泡均存在，生育力正常。然而考虑到小鼠为多排卵动物，和单排卵的人类存在差异，尚不能完全排除C3orf33对卵巢功能的影响，我们拟进一步通过体外实验研究C3orf33在人卵巢发育中的作用。<br>　　综上，本论文基于1030例POI患者的WES数据，发现了14个POI潜在致病新基因;明确了在特发性POI中，遗传变异可解释21.65％患者的发病原因;基于一例家系的WES数据发现C3orf33为POI患者的新候选基因，并在1030例散发病例得到重复。上述结果拓展了POI致病基因的突变谱，为POI的分子诊断和风险预警提供了线索。