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摘要研究背景及目的<br>　　多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是一种克隆性浆细胞异常增殖的恶性疾病，约占血液系统恶性肿瘤的10％，其特征为骨髓中克隆浆细胞浸润和血清和/或尿液中有单克隆免疫球蛋白，这些免疫球蛋白的积累可导致器官功能障碍，通常称为“CRAB”，即血钙增高(Calcium elevation)、肾功能损害(Renal insufficiency)、贫血(Anemia)和骨病(Bone disease)。MM的治疗包括糖皮质激素、烷基化剂、蒽环类药物、蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物、组蛋白乙酰化酶抑制剂和单克隆抗体。然而，MM患者在一个或多个治疗方案后总是会进入复发/难治阶段，主要的原因就是耐药。考虑到低成本、低风险和更少的时间消耗等优点，将已获批准的药物重新用作新的抗癌药物成为了一种新兴的治疗策略。<br>　　双硫仑(Disulfiram，DSF)于1951年被美国食品和药物管理局(Food and drug administration，FDA)批准为治疗酒精中毒的药物在临床上广泛使用了60多年。DSF是肝脏乙醛脱氢酶(Acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)的抑制剂，在体内，DSF被代谢为二乙基二硫代氨基甲酸酯(Diethyldithiocarbamate，DTC)和其他代谢物，可导致乙醛的特异性堆积，在饮酒时产生呼吸过速、心动过速、恶心、呕吐和低血压等不适症状，因此是一种抗酒精中毒的药物。近年来，许多研究表明DSF可作为一种有效的抗实体瘤药物被重新利用，如它可以抑制乳腺癌、结肠癌和黑色素瘤的发生发展。还有研究表明DSF联合铜(Copper，Cu)可增强其抗肿瘤效应。Cu是参与基本生命过程的一种基本微量元素，许多关键性的酶和转录因子必须依赖于Cu才能在生物体内发挥作用。DSF作为一种二价金属离子螯合剂，可以与Cu形成DSF/Cu络合物，这种络合物可降低DSF难溶于水的特性，使其更容易被细胞吸收。近来有许多研究表明DSF/Cu络合物对多种癌细胞具有细胞毒作用，而对正常细胞没有影响。<br>　　本研究旨在通过体内外实验观察DSF是否具有抗MM的作用以及深入探索其抗MM效应的作用机制，为DSF临床应用治疗MM提供理论与实验依据。<br>　　研究方法<br>　　1.采用MTT法，检测不同浓度单用DSF(0.05、0.1、0.25和0.5μM)及DSF/Cu双药联合(0.05/0.5、0.1/0.5、0.25/0.5和0.5/0.5μM)对MM.1S和RPMI8226细胞株细胞活性的影响。检测不同时间点12h、24h和48h单用DSF或DSF/Cu双药联合对MM.1S和RPMI8226细胞株细胞活性的影响。观察DSF或DSF/Cu对MM细胞株的细胞毒作用是否具有浓度依赖性和时间依赖性。<br>　　2.采用MTT法，检测同一浓度单用DSF及DSF/Cu双药联合对MM细胞株及人正常外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)的影响。<br>　　3.采用AnnexinV-FITC/PI染色法检测不同浓度DSF/Cu(0.1/0.5、0.25/0.5和0.5/0.5μM)对MM.1S和RPMI8226细胞株细胞凋亡的影响。同时检测不同时间点24h和48hDSF/Cu双药联合对MM细胞株细胞凋亡的影响。观察DSF/Cu对MM细胞株的细胞凋亡作用是否具有浓度依赖性和时间依赖性。<br>　　4.采用流式细胞术检测DSF/Cu对MM患者原代骨髓瘤细胞的影响。<br>　　5.采用PI染色法检测不同浓度DSF/Cu对MM细胞株细胞周期的影响。<br>　　6.采用JC-1线粒体膜电位检测试剂观察DSF/Cu诱导MM细胞株凋亡时线粒体的变化，探讨DSF/Cu对MM细胞株凋亡作用是否通过线粒体依赖的内源性凋亡途径。<br>　　7.经DSF/Cu预处理MM细胞株后，采用WesternBlot法检测caspase-3、caspase-8活性与cleavedPARP蛋白的表达。加入广泛性caspase抑制剂Z-VAD-FMK(zVAD)，进一步观察caspase-3和cleavedPARP蛋白表达的变化，以此明确DSF/Cu诱导MM细胞株凋亡是否通过caspase依赖的凋亡途径。<br>　　8.采用WesternBlot法检测JNK、P-JNK、P-c-jun、ERK和P38MAPK蛋白的表达。加入JNK抑制剂SP600125后，观察P-JNK蛋白表达的变化，探讨MAPK通路在DSF/Cu诱导MM细胞株凋亡的作用。<br>　　9.通过在NOD/SCID小鼠皮下接种MM细胞，建立人MM细胞移植瘤动物模型后，观察DSF/Cu对荷瘤小鼠移植瘤生长和生存期的影响，探讨DSF/Cu在体内的抗骨髓瘤作用。<br>　　研究结果<br>　　1.单用DSF或DSF/Cu双药联合对MM.1S和RPMI8226细胞均有明显的抑制作用，并呈浓度依赖性，单用DSF的细胞抑制率的IC50分别为0.32±0.04μM和0.87±0.03μM，而DSF/Cu双药联合的IC50分别为0.23±0.18μM和0.25±0.02μM，因此可以发现DSF/Cu双药联合对MM细胞的活性抑制作用更强。另外我们发现Cu对细胞生长的抑制率极低，基本没有毒性作用。而单用DSF或DSF/Cu双药联合预处理MM细胞株12h、24h和48h后，MTT结果显示DSF或DSF/Cu对MM细胞的活性抑制作用呈时间依赖性，且DSF/Cu双药联合对MM细胞的活性抑制作用更强。<br>　　2.采用同一浓度DSF单药或DSF/Cu双药联合对PBMC和MM.1S细胞预处理12h后，MTT结果显示同等浓度下DSF单药或DSF/Cu双药联合，对MM细胞的毒性远远大于对人PBMC的细胞毒性。<br>　　3.因为前期的MTT实验结果均表明，DSF/Cu双药联合具有更强的抑制MM细胞活性的作用，因而仅采用DSF/Cu双药联合作为处理组进行后续实验。AnnexinV-FITC/PI染色法检测细胞凋亡实验结果表明DSF/Cu对MM细胞具有诱导凋亡的作用，且这种诱导作用具有剂量依赖性和时间依赖性。<br>　　4.从7例初诊或复发/难治MM患者的骨髓中提取了骨髓单个核细胞(Bone Marrow Mononuclear Cell，BMMC)作为研究对象，加入DSF/Cu(0.5/0.5μM)预处理24h后，MM原代骨髓瘤细胞的凋亡比例为69.1±9.3％。上述实验结果表明DSF/Cu双药联合可以诱导MM原代骨髓瘤细胞凋亡。<br>　　5.以不同剂量DSF/Cu(0.1/0.5、0.25/0.5和0.5/0.5μM)处理MM.1S和RPMI8226细胞12h后，流式细胞术结果表明与对照组相比，经药物处理后MM细胞的G2/M期比例明显增高，考虑DSF/Cu双药联合可使MM细胞周期阻滞于G2/M期，并呈剂量依赖性。<br>　　6.将MM.1S和RPMI8226细胞经DSF/Cu(0.25/0.5μM)预处理12h后，流式细胞术结果表明MM细胞中JC-1单体的比例明显增高，荧光显微镜下所示，正常的MM.1S和RPMI8226细胞因JC-1为多聚体而呈现黄绿色，在DSF/Cu干预后，出现大量的早期和晚期凋亡细胞，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，红光强度减弱，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光，因此显微镜下MM.1S和RPMI8226细胞呈现绿色。这些结果均表明DSF/Cu诱导MM细胞株凋亡的作用是通过线粒体依赖的内源性凋亡途径。<br>　　7.以不同剂量DSF/Cu(0.1/0.5、0.25/0.5和0.5/0.SμM)处理MM.1S和RPMI8226细胞12h后，WesternBlot检测结果显示caspase-8、caspase-3和PARP活化，pro-caspase-8和pro-caspase-3表达明显下降，而cleavedcaspase-8和cleavedcaspase-3表达明显增多，同时cleavedPARP表达也明显上升。另外，在药物预处理前1h，加入20μM的广泛性caspase抑制剂zVAD，流式细胞术检测发现MM细胞的凋亡比例明显下降，同时WesternBlot结果显示，加入zVAD后，pro-caspase-3表达明显增多，而cleavedcaspase-3和cleavedPARP表达明显减少。这些结果均表明caspase依赖的凋亡途径是DSF/Cu诱导MM细胞株凋亡的机制之一。<br>　　8.以不同剂量DSF/Cu(0.1/0.5、0.25/0.5和0.5/0.5μM)处理MM.1S和RPMI8226细胞12h后，WesternBlot检测结果显示磷酸化JNK和c-Jun表达量明显增高，而JNK、P38MAPK和ERK的总蛋白表达量没有明显变化。另外，在DSF/Cu预处理前2h，加入了20μM的JNK抑制剂SP600125，流式细胞术检测发现MM细胞的凋亡比例明显下降，同时WesternBlot结果显示，加入SP600125后，P-JNK表达明显减少。上述实验结果表明，MAPK通路可能也是DSF/Cu双药联合诱导MM细胞凋亡的机制之一。<br>　　9.通过对NOD/SCID小鼠皮下接种RPMI8226细胞(1×107/只)，建立了NOD/SCID骨髓瘤荷瘤小鼠模型。在肿瘤体积达到200mm3后，采用灌胃的方式给予小鼠DSF/Cu，连续给药14天。当小鼠到达时间截止点后，我们采用脱颈的方式处死小鼠。肿瘤体积测量曲线显示从第4天开始，DSF/Cu处理组小鼠肿瘤体积增长速度即远远低于对照组(P＜0.001)。对小鼠肿瘤的重量称重结果显示DSF/Cu处理组小鼠肿瘤重量远远小于对照组。出于人道主义考虑，对于观察荷瘤小鼠总生存期组，将荷瘤小鼠的肿瘤任意一个方向直径超过2cm或小鼠不能爬行或进食食水作为实验终止点，脱颈处死小鼠。结果发现，DSF/Cu处理组与对照组小鼠平均生存期分别为31天和25.5天，DSF/Cu能明显延长MM荷瘤小鼠生存期(P＜0.001)。以上结果说明DSF/Cu在体内不仅能抑制骨髓瘤细胞生长，还能够延长MM荷瘤小鼠生存期。<br>　　结论<br>　　1.DSF或DSF/Cu对MM细胞株有细胞毒作用，且细胞毒作用具有浓度依赖性和时间依赖性。DSF单药与DSF/Cu双药联合相比，DSF/Cu双药联合对MM细胞的活性抑制作用更强。<br>　　2.同等浓度下DSF单药或DSF/Cu双药联合，对MM细胞的毒性远远大于对人PBMC的毒性。<br>　　3.DSF/Cu能诱导MM细胞凋亡，这种促凋亡作用具有浓度依赖性和时间依赖性。同时DSF/Cu能诱导MM患者原代骨髓瘤细胞凋亡。<br>　　4.DSF/Cu可以使MM细胞的细胞周期阻滞于G2/M期。<br>　　5.DSF/Cu诱导MM细胞凋亡时，发生线粒体膜电位改变，证实线粒体依赖的内源性凋亡途径是DSF/Cu诱导MM细胞凋亡的机制之一。<br>　　6.DSF/Cu诱导MM细胞凋亡还依赖于caspase活化的凋亡途径和MAPK信号通路的调节。<br>　　7.DSF/Cu能减慢荷瘤小鼠肿瘤生长速度，并延长荷瘤小鼠生存期。