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摘要真核细胞中细胞骨架在维持细胞基本形态、细胞运动分化、物质运输、信息传递等重大生命活动中发挥重要作用，其概念在不断地发展中。细胞质骨架主要成分包括微管、微丝和中间纤维，其中微管和微丝最具动态特征，其聚合和解聚过程受到精密调控。构成微管和微丝的蛋白质中广泛存在各种氨基酸翻译后修饰(PTMs)，PTMs以不同的方式介导微管和微丝的功能，如改变微管和微丝的内部特性或招募新的效应蛋白来调节下游信号通路。因此，研究关键氨基酸残基上特定PTM产生和消除的分子基础，不仅可以深入了解PTMs介导的细胞骨架蛋白生物学功能的意义，而且还有助于我们理解细胞蛋白质组学的复杂性。本篇论文主要研究的是人源KANK1/2蛋白调节细胞周围基质微管生长的分子机制，以及人源SETD3蛋白对肌动蛋白His73N3甲基化修饰的分子基础。<br>　　本文第一部分介绍了KANK家族蛋白KANK1/2通过对驱动蛋白KIF21A的识别来限制细胞边缘微管的过度生长来防止微管灾变的发生。我们用GSTpull-down法和等温量热滴定法(ITC)检测KIF21A与KANK1/2的体外结合。通过对晶体结构的分析，我们发现KIF21A与KANK1/2结合后，采用螺旋-连接体-螺旋构象，两端形成两个螺旋，在复合物结构中，KANK1/2通过一个酸性斑块和一个疏水沟与KIF21A小肽结合，KANK1/2和KIF21A之间广泛的相互作用表明KANK1/2以序列依赖的方式识别KIF21A的小肽片段。突变和ITC结合实验进一步验证了KANK1/2与KIF21A小肽的结合界面，鉴定了与KIF21A结合有关的KANK1/2关键残氨基酸基，这些残基在不同物种间具有保守性。此外，通过序列比对和详细的结构分析，我们发现尽管KANK蛋白的ankyrin结构域之间具有高度的序列一致性，KANK1/2结合KIF21A的关键氨基酸残基在KANK3和KANK4这两个KANK家族成员中并不保守，这表明KANK家族成员可能在进化过程中进化出不同的细胞功能，这需要进一步的研究来揭示KANK3/4的在细胞中的生物学功能。<br>　　本文第二部分研究了SETD3介导肌动蛋白His73的N3发生甲基化修饰的分子基础。生化证据表明，His73的N3甲基化通过调节ATP水解后γ-磷酸基的释放过程来维持肌动蛋白的多聚状态。从发现His73的N3甲基化至今已经有50多年了，直到最近SETD3才被发现作为肌动蛋白组氨酸的甲基化转移酶，对照实验证明了SETD3不是组蛋白H3K4或H3K36的甲基转移酶，因此，SETD3是SET结构域家族蛋白中第一个发现的非赖氨酸甲基转移酶。通过ITC结合实验，我们发现含有His73的肌动蛋白片段与SETD3有很高的亲和力，相反，H3K4和H3K36肽段均不显示与SETD3结合的亲和力。此外，质谱数据还表明SETD3能有效地催化含His73的肌动蛋白肽段甲基化。为了揭示SETD3的底物识别和催化机理，我们用X射线晶体学方法解析了在S-腺苷高半胱氨酸(SAH)存在下的两个SETD3复合物结构，其中一个与未修饰的肌动蛋白片段结合，另一个与其甲基化的形式结合，这两种结构分别代表了催化前和催化后的状态。在未发生催化的复合物中，我们发现His73被定位在一个特定的口袋中，其取向是通过与口袋中氨基酸残基的氢键相互作用来确定的，在催化作用下，His73的咪唑环旋转了90°，以避免潜在的空间位阻并为随后的产物释放做准备。SETD3以序列依赖的方式识别肌动蛋白，我们测定了SETD3及其突变体对SAM和全长肌动蛋白的酶活动力学参数，表明无论是SAM结合的突变还是肌动蛋白结合的突变都显著降低了SETD3对全长肌动蛋白的活性。总之，我们的结构不仅揭示了SETD3对肌动蛋白的识别和催化机制，还为今后设计有效的SETD3抑制剂以治疗相关的人类疾病提供了参考。