肺癌免疫化疗及LCN2干预治疗的探究-论文-万方医学网

肺癌免疫化疗及LCN2干预治疗的探究

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摘要癌症是影响人类生命健康的四大疾病之一。其中，肺癌的发病率在众多癌症中高居首位，肺癌的发生和许多基因的变化密切相关。25％的肺癌患者中都会发生KRAS的突变，但是目前针对这种突变的肺癌病人并没有太好的治疗方法。IL-12作为一种强效的免疫活化性的细胞因子应用于许多肿瘤疾病的临床前研究，但是IL-12对于肺癌的治疗效果以及机制还并不很清楚。 　　另一方面，约40％的肺癌晚期病人会进展为恶液质，表现为显著的体重降低，肌肉组织和脂肪组织等多种器官的萎缩。目前主要认为，恶液质病人体内是一种高度炎性的环境，但是调节炎性反应的免疫细胞在恶液质中扮演的具体的角色仍鲜有报道。肺癌恶液质的关键驱动因子目前知之甚少，且临床上针对肿瘤引起的恶液质的治疗方案十分有限。 　　本文主要从探究早期和中期的肺癌的免疫治疗和晚期肺癌导致的恶液质的关键驱动因子及治疗方案两方面进行研究，取得了以下的结果。 　　Ⅰ、曲美替尼联合IL-12有效治疗KRAS驱动的肺癌 　　1.曲美替尼上调肺癌肿瘤细胞的免疫原性 　　体外对多种肺癌细胞系进行药物处理，使用免疫荧光及流式细胞术检测CRT和HMGB1分子的表达，鉴定出曲美替尼能够上调肺癌肿瘤细胞的免疫原性。 　　2.曲美替尼联合IL-12有效抑制小鼠皮下瘤的生长，并能在体内上调肿瘤细胞的免疫原性 　　对LLC皮下瘤小鼠进行药物处理，流式检测瘤内DC细胞的表型。结果表明，曲美替尼可以促进瘤内DC细胞的活化。构建LLC细胞皮下瘤及Kras自发肺癌组织来源的皮下瘤小鼠模型，对小鼠进行曲美替尼和IL-12的联合治疗，我们发现，联合治疗能够后，肿瘤的进展明显被抑制，小鼠的存活时间也明显得到延长。对肿瘤组织切片进行CRT、HMGB1和HSP70分子的免疫荧光染色，结果显示曲美替尼单独使用或者联合治疗都可以在体内上调肿瘤细胞的免疫原性。 　　3.曲美替尼联合IL-12明显抑制Kras突变驱动的自发肺癌的生长，并能在体内上调肿瘤细胞的免疫原性 　　利用Cre慢病毒滴鼻处理Kras突变小鼠，诱导小鼠自发肺癌，分别从早期和中期对自发肺癌小鼠进行曲美替尼和IL-12的联合治疗。结果表明，联合治疗后，早期和中期的肺癌进展受到抑制。对肺癌组织切片进行CRT、HMGB1和HSP70分子的免疫荧光染色，结果显示曲美替尼单独使用或者联合治疗都可以在体内上调肿瘤细胞的免疫原性。 　　4.曲美替尼联合IL-12明显促进肺癌原位NK细胞和T细胞的活化 　　构建LLC细胞肺转移模型、Kras自发肺癌组织来源的皮下瘤以及Kras突变自发肺癌小鼠模型，对荷瘤小鼠进行治疗。流式结果表明，曲美替尼联合IL-12明显增加瘤内T细胞的数量，并且上调NKG2D+NK细胞及CD62L-CD44+T细胞的比例，还能够明显降低MDSC和Treg这些免疫抑制性细胞的比例。 　　5.曲美替尼联合IL-12明显上调肺癌原位NK细胞和T细胞的抗肿瘤功能 　　构建LLC细胞肺转移模型以及Kras突变自发肺癌小鼠模型，对荷瘤小鼠进行治疗。流式检测结果表明，曲美替尼联合IL-12明显促进瘤内NK细胞和CD8+T细胞表达抗肿瘤功能分子TNFα及granzymeB。构建LLC细胞皮下瘤模型以及Kras突变自发肺癌小鼠模型，对荷瘤小鼠进行治疗。纯化瘤内NK细胞进行体外杀伤，流式及ELISA结果表明，曲美替尼联合IL-12治疗有效上调肿瘤内NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力及IFNγ分泌能力。使用抗体清除小鼠体内的NK细胞或CD8+T细胞，再进行联合治疗，荷瘤小鼠的生存期相较于未清除细胞组明显缩短，表明联合治疗的抗肿瘤能力依赖于NK细胞和CD8+T细胞。 　　综上所述，本研究鉴定出Kras下游的抑制剂曲美替尼具有提高肿瘤细胞免疫原性的作用。将其与IL-12联合对多种肺癌小鼠模型治疗，都得到良好的治疗效果。这种联合治疗在体内不仅可以提高T细胞的数量，活化NK细胞和T细胞，还能够提高二者的抗肿瘤功能。本研究为KRAS突变的肺癌病人提供了新的治疗方案。 　　Ⅱ、LCN2驱动肿瘤恶液质引发的全身性组织萎缩 　　1.恶液质病人及恶液质小鼠体内均高表达LCN2 　　对恶液质病人、普通肺癌病人及健康人的外周血进行蛋白芯片检测，分析芯片数据，结果表明，恶液质病人体内高表达LCN2。扩大样本进行血清ELISA，验证了芯片的结果。接着构建并鉴定了LLC皮下瘤诱导的小鼠模型，对恶液质小鼠及健康小鼠血清进行蛋白芯片检测，芯片结果表明，恶液质小鼠体内也高表达LCN2。随后利用qPCR和ELISA在LLC皮下瘤模型及肺癌PDX模型中都验证了恶液质小鼠确实高表达LCN2。 　　2.LCN2促进小鼠恶液质的发生 　　制备LCN2过表达的慢病毒并以尾静脉的途径注射给小鼠。我们发现，LCN2过表达的小鼠表现出类似恶液质的体重减轻，脂肪和肌肉组织萎缩的现象。 　　3.恶液质的LCN2主要由中性粒细胞产生 　　流式结果表明，恶液质小鼠体内多种器官的髓系细胞大量增加。进而我们通过qPCR，westernblot和流式鉴定出LCN2主要来自于中性粒细胞。对人的外周血进行流式检测，也发现中性粒细胞数量明显增加且主要产生LCN2。 　　4.清除中性粒细胞明显缓解恶液质造成的萎缩 　　对恶液质小鼠使用抗体清除中性粒细胞，我们发现，清除中性粒细胞后可以明显抑制肿瘤的生长，缓解恶液质造成的体重减轻，脂肪萎缩的症状。 　　5.抗体清除LCN2明显缓解恶液质造成的萎缩 　　对恶液质小鼠使用抗体清除LCN2，我们发现，清除LCN2后可以明显抑制肿瘤的生长，缓解恶液质造成的体重减轻，脂肪萎缩的症状。 　　6.恶液质脂肪细胞铁死亡途径上调 　　对恶液质小鼠的脂肪组织进行转录组测序，分析结果，我们发现，恶液质小鼠的脂肪组织中铁死亡通路明显富集上调。利用qPCR、流式细胞术、ELISA检测多种指标，验证了恶液质的脂肪细胞确实铁死亡程度增加。 　　7.铁死亡抑制剂DFO治疗明显缓解恶液质造成的萎缩 　　对恶液质小鼠使用铁死亡抑制剂DFO治疗，我们发现，DFO治疗明显抑制肿瘤的生长，并且缓解恶液质造成的体重减轻，脂肪萎缩的症状。 　　综上所述，本研究鉴定了LCN2是肿瘤恶液质的关键驱动因素，并且LCN2主要来自于中性粒细胞。LCN2的上调促进铁的转运进而造成脂肪细胞的铁死亡。清除中性粒细胞或LCN2，或者抑制铁死亡，都能够有效缓解恶液质的症状。本研究为肿瘤恶液质的诊断和治疗提供了新思路。