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摘要背景和目的<br>　　食管癌是世界上最严重的癌症之一，其发病率居于第七位，而死亡率居于第六位。根据组织病理学特点，食管癌分为食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和食管腺癌(Esophageal adenocarcinoma, EAC)。我国是食管癌的高发地区，其中食管鳞状细胞癌较为常见。许多食管癌患者在诊断时即表现出局部浸润和远处转移，而由肿瘤转移引起的并发症，是导致患者预后差和五年生存率低的重要原因。目前放化疗、手术治疗等治疗措施被广泛应用于食管癌患者的临床治疗中，但由于手术治疗的局限性、传统化疗药物的耐受以及食管癌的高转移复发性，使得患者的治疗效果差，预后不理想，因此发现新的高效低毒的抗食管癌复发转移的药物，对改善食管癌患者预后和提高其生存率具有重要意义。<br>　　青蒿素，是从天然革本植物黄花蒿中提取出的一种倍半萜烯三氧杂环己烷内酯类药物，在临床中主要用于治疗疟疾。大量研究表明，青蒿素以及其衍生物除了在抗疟疾方面具有高效低毒的治疗作用，在抗肿瘤方面也具有显著的治疗效果。双氢青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)，是青蒿素及其衍生物在体内的主要代谢产物，是临床常用的抗疟疾药物之一。研究表明双氢青蒿素可以通过诱导肿瘤细胞的凋亡、自噬、氧化应激损伤，抑制血管生成以及调控肿瘤相关信号转导通路而发挥显著的抗肿瘤作用。关于双氢青蒿素在食管鳞癌中发挥的作用，有研究表明其可以显著抑制食管鳞癌的发生发展，且我们课题组前期证明双氢青蒿素可以通过靶向AKT1、p70S6K激酶下调mTOR-p70S6K-RPS6信号通路抑制食管鳞癌的增殖，但关于双氢青蒿素对食管鳞癌转移方面的影响报道较少，对其具体机制尚不清楚。在本研究中，我们致力于探讨双氢青蒿素对食管癌转移的影响及其具体分子机制，为双氢青蒿素应用于临床抗食管癌复发转移的治疗奠定坚实基础。<br>　　方法<br>　　1.探索双氢青蒿素对食管鳞癌细胞迁移和侵袭的影响。<br>　　利用划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测不同浓度双氢青蒿素对食管鳞癌细胞Kyse30和Kyse150迁移和侵袭能力的影响。<br>　　2.探索双氢青蒿素对食管鳞癌细胞上皮间充质转化(EMT)的影响。<br>　　利用蛋白质免疫印迹实验检测食管鳞癌细胞Kyse30和Kyse150经不同浓度双氢青蒿素处理24h或双氢青蒿素(10μM)处理不同时间后，EMT相关蛋白的表达变化水平;利用免疫荧光检测食管鳞癌细胞Kyse30和Kyse150经双氢青蒿素(0、10μM)处理24h后，细胞膜上E-cadherin和N-cadherin的表达情况。<br>　　3.磷酸化蛋白质组学探索双氢青蒿素抑制食管鳞癌细胞迁移和侵袭的作用机制。<br>　　食管鳞癌细胞Kyse30经双氢青蒿素(0、10μM)处理24h后，利用磷酸化蛋白质组学技术，进行基于质谱的磷酸化蛋白质组学分析及KEGG、GO富集分析，并通过蛋白质免疫印迹实验进一步验证。<br>　　4.探索敲低或过表达Gli3对食管鳞癌细胞迁移侵袭及EMT的影响。<br>　　在食管鳞癌细胞中敲低或过表达Gli3，观察对食管鳞癌细胞Kyse30和Kyse150迁移和侵袭的影响，以及对Snail、Slug和E-cadherin蛋白表达的影响。<br>　　5.探索Gli3调控Snail和Slug蛋白表达的作用机理。<br>　　在敲低或过表达Gli3的基础上，利用qRT-PCR实验检测Gli3在转录水平对Snail和Slug的影响;在敲低Gli3的基础上，加入蛋白质合成抑制剂放线菌酮和蛋白酶体抑制剂MG132检测Gli3对Snail和Slug蛋白稳定性的影响。<br>　　6.探索双氢青蒿素在体内对食管鳞癌细胞转移的影响。<br>　　利用尾静脉注射方法构建食管鳞癌细胞Kyse150转移模型，并通过小动物活体成像、HE染色和免疫组化评价双氢青蒿素在体内抑制食管鳞癌细胞转移的疗效。<br>　　结果<br>　　1.与对照组相比，双氢青蒿素抑制了食管鳞癌细胞Kyse30和Kyse150的迁移和侵袭能力。<br>　　2.与对照组相比，双氢青蒿素以浓度梯度和时间梯度方式抑制了食管鳞癌细胞Kyse30和Kyse150的上皮间充质转化相关蛋白N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug的表达，而促进了E-cadherin的表达。<br>　　3.磷酸化蛋白质组学揭示了Hedgehog信号通路被显著富集，且蛋白质免疫印迹实验证明双氢青蒿素下调该通路中Gli3S664的磷酸化水平。<br>　　4.敲低Gli3抑制了Snail/Slug蛋白的表达而促进了E-cadherin蛋白的表达，进而抑制食管鳞癌细胞Kyse30和Kyse150的迁移和侵袭;过表达Gli3促进了Snail/Slug蛋白的表达而抑制了E-cadherin蛋白的表达，进而促进食管鳞癌细胞Kyse30和Kyse150的迁移和侵袭。<br>　　5.在敲低或过表达Gli3的条件下，Snail和Slug的mRNA表达水平未随之发生显著变化;而在敲低Gli3的基础上加入蛋白质合成抑制剂放线菌酮，Snail和Slug蛋白的半衰期缩短;在敲低Gli3的基础上加入蛋白酶体抑制剂MG132显示Snail/Slug蛋白的积聚，这表明Gli3是在蛋白翻译后修饰水平通过维持Snail/Slug蛋白的稳定性而调控其表达。<br>　　6.在体内，双氢青蒿素抑制了食管鳞癌细胞Kyse150的转移;且与对照组相比，双氢青蒿素治疗组E-cadherin的表达升高，而N-cadherin、Gli3S664、Snail的表达降低。<br>　　结论<br>　　双氢青蒿素通过Gli3-Snail/Slug影响上皮间充质转化的发生而抑制食管鳞癌细胞的转移。