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摘要子宫内膜基质细胞(Endometrial stromal cells，ESC)蜕膜化成功是胚胎着床和妊娠建立的前提条件。目前已证实蜕膜化受损是反复着床失败(Recurrent implantation failure，RIF)的关键病因，但其潜在机制尚不清楚。<br>　　蜕膜化是一个复杂的生物学过程，涉及众多生物学过程例如细胞骨架、细胞外基质分解、细胞周期、血管生成、细胞自噬、炎症反应等，以及相关转录组、蛋白组、代谢组的改变。因此，介导蜕膜化受损的原因和机制充满多样性和不确定性。尽管，针对目前可能造成蜕膜化受损的因素进行了针对性治疗以改善胚胎着床率，但近几年来RIF不孕患者临床妊娠率并未得到显著改善，因此，寻找介导异常蜕膜化的关键调控因子及揭示其在蜕膜化过程中的相关分子机制具有非常重要的临床意义。<br>　　前动力蛋白2(Prokineticin2，PK2)是一种多功能分泌蛋白，研究表明PK2参与细胞分化、细胞自噬、血管形成、昼夜节律、细胞周期、炎性反应等生理功能。然而，PK2在子宫内膜中的作用尚不清楚。<br>　　本课题组前期研究发现RIF患者黄体中期子宫内膜组织PK2、PKR1表达水平较对照组患者显著升高，细胞实验显示，过表达PK2慢病毒感染子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化相比于空载体蜕膜化组，细胞蜕膜化形态改变不明显，且蜕膜化标志物IGFBP1表达水平未升高，表明PK2表达增加可导致子宫内膜蜕膜化过程受损。<br>　　RNA测序(RNA-Sequencing,RNA-seq)即通过高通量测序技术把转录组中mRNA，small RNA，NONcoding RNA等进行测序分析，反映出它们在细胞中的表达水平。本课题组前期通过RNA-seq得出PK2过表达蜕膜化和空载体蜕膜化基质细胞显著改变的lncRNA及mRNA表达谱，拟通过转录调控研究PK2调控蜕膜化的分子机制。<br>　　本研究基于课题组前期RNA-seq技术检测lncRNA与mRNA的表达谱变化，结合生物信息学分析技术，筛选出参与PK2调控蜕膜化过程的靶基因lncRNA与mRNA，于原代子宫内膜细胞中验证RNA和相关蛋白表达水平，并构建对照组空载体+未蜕膜化组、对照组空载体+蜕膜化组、过表达PK2+蜕膜化组、PK2-siRNA+蜕膜化组慢病毒转染的细胞模型，进一步确定目的靶基因，探索PK2调控蜕膜化过程的分子机制。<br>　　目的:<br>　　1.根据RNA-seq结果，结合生物信息学分析技术，初步筛选出参与PK2调控蜕膜化过程的靶基因;<br>　　2.验证靶基因在原代细胞中表达，并构建慢病毒转染的蜕膜化模型进一步确定目的靶基因，探索PK2调控蜕膜化过程的分子机制。<br>　　方法:<br>　　(1)筛选2019年1月至2020年1月于郑州大学第一附属医院生殖医学中心行IVF/ICSI助孕并且符合纳排标准的RIF患者及对照组患者(Conrtol组)，采集黄体中期子宫内膜。<br>　　(2)根据PK2过表达蜕膜化和空载体蜕膜化基质细胞RNA-seq得出的差异LncRNA与mRNA，结合生物学分析技术及现有研究，初步筛选出PK2可能转录调控的基因。<br>　　(3)通过RT-qPCR分析RIF和正常患者黄体中期子宫内膜组织的LUCAT1、RAMP2-AS1、AL034397.3、mir199a-5p、MMP9、TRPM2、CDKN1C、ULK1、NLRP3表达水平;<br>　　(4)通过Western-blotting分析两组患者黄体中期子宫内膜组织的MMP9、TRPM2、LC3B表达水平<br>　　(5)通过RT-qPCR和Western-blotting分析正常蜕膜化过程中LUCAT1、MMP9、TRPM2及LC3B表达水平;<br>　　(6)通过构建对照组空载体+未蜕膜化组、对照组空载体+蜕膜化组、过表达PK2+蜕膜化组、PK2-siRNA+蜕膜化组慢病毒转染的细胞模型，采用RT-qPCR、Western-blotting的方法验证PK2的过表达或敲低对LUCAT1、MMP9、TRPM2及自噬标记物LC3B表达水平的影响。<br>　　结果:<br>　　1.结合信息学分析技术，初步筛选出PK2可能通过LUCAT1/RAMP2-AS1-MMP9;AL034397.3-mir199a-5p-CDKN1C;TRPM2-自噬(ULK1)/NLRP3途径调控蜕膜化;<br>　　2.RT-qPCR结果显示RIF组LncRNA-LUCAT1表达水平显著高于Control组，而mRNA MMP9、TRPM2表达水平显著低于Control组(P＜0.05);<br>　　3.Western-blotting显示RIF组MMP9、TRPM2、LC3B蛋白表达水平低于对照组;<br>　　4.正常蜕膜化过程中LUCAT1的RNA表达呈略微下降，MMP9、TRPM2的mRNA和蛋白表达水平呈上升趋势，LC3B蛋白表达水平呈上升趋势。<br>　　5.RT-qPCR和Western-blotting显示过表达PK2组+蜕膜化组与未蜕膜化组LUCAT1的RNA表达量高于PK2-siRNA组+蜕膜化组与正常蜕膜化组，MMP9、TRPM2的mRNA和蛋白表达水平明显低于另外两组(P＜0.05);<br>　　6.Western-blotting显示过表达PK2组+蜕膜化组与未蜕膜化组LC3B蛋白表达水平低于PK2-siRNA组+蜕膜化组与正常蜕膜化组(P＜0.05);<br>　　结论:<br>　　1.RIF患者子宫内膜基质细胞中存在MMP9表达不足与一定程度的自噬受损;<br>　　2.正常蜕膜化过程中TRPM2、MMP9呈上升趋势，而LUCAT1呈下降趋势，且基质细胞自噬作用增强;<br>　　3.PK2过表达可抑制细胞自噬及MMP9表达;<br>　　4.PK2-LUCAT1-MMP9或PK2-TRPM2-自噬途径可能参与调控RIF患者子宫内膜蜕膜化过程。