检索历史 清除

摘要目的:<br>　　建立适合乙肝核心蛋白病毒样颗粒（Hepatitis B core virus-like particles，HBc VLPs）批量生产的发酵表达工艺、分离纯化路线以及纯度检测方法，制备出纯度较好的HBc VLPs，将其作为药物载体，负载CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG oligonucleotide，CpG-ODN），制备成CpG@HBc VLPs纳米复合物，探究其在乳腺癌等实体肿瘤临床治疗方面的应用。<br>　　方法:<br>　　1.通过大肠杆菌表达系统生产HBc VLPs，验证不同的初始培养基pH值、诱导时机、诱导剂浓度、诱导温度以及诱导时长对菌体生长和目的蛋白表达量的影响，确定最佳发酵表达条件。<br>　　2.利用凝胶过滤层析、离子交换层析、蔗糖密度梯度离心等蛋白分离纯化技术对表达的目的蛋白进行纯化，提高HBc VLPs的纯度。<br>　　3.利用高效液相色谱法对HBc VLPs纯化工艺过程中各阶段蛋白的纯度进行检测，并对该方法的专属性、线性和重复性进行验证。<br>　　4.选取纯度较好的HBc VLPs，通过解聚包封法负载CpG-ODN制备成CpG@HBc VLPs纳米复合物。利用制备好的CpG@HBc VLPs对小鼠乳腺癌肿瘤模型进行原位注射治疗，验证CpG@HBc VLPs纳米复合物的安全性和有效性。<br>　　结果:<br>　　1.建立了大肠杆菌表达系统发酵生产HBc VLPs的新工艺，确定最佳发酵培养条件为初始培养基pH值7.2、诱导时机为菌体浓度OD600值1.8、IPTG诱导剂浓度0.8mmol/L、诱导温度26℃、诱导时长16h，应用此发酵工艺诱导表达时菌体的OD600值可以达到3.4，目的蛋白表达量达到0.36g/L。<br>　　2.建立了凝胶过滤层析、离子交换层析和蔗糖密度梯度离心相结合的分离纯化路线，经高效液相色谱法检测HBc VLPs纯度可以达到95％以上。<br>　　3.对高效液相色谱检测HBc VLPs纯度的方法进行验证，HBc VLPs在设定的积分范围内出现特殊吸收峰;样品浓度在0.02～1mg/mL时，溶液浓度与吸收峰峰面积呈线性相关，相关系数R2=0.999;6次重复进样峰面积相对标准偏差(RSD)为0.47％。该方法的专属性、线性和重复性均符合要求。<br>　　4.本研究制备的CpG@HBc VLPs纳米复合物对乳腺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长具有明显的抑制作用，与对照组相比肿瘤减小60.29％。<br>　　结论:<br>　　1.本研究建立了一套完整的乙肝核心蛋白病毒样颗粒表达、纯化及质检工艺，能够批量制备纯度较高的HBc VLPs。<br>　　2.本研究成功制备了CpG@HBc VLPs纳米复合物，其对乳腺癌实体肿瘤具有明显抑制作用。