检索历史 清除

摘要外泌体是细胞分泌的直径为30～150nm的细胞外囊泡，广泛分布于各种体液中，携带与其母细胞相关的蛋白、脂质和核酸等生物信息，能够稳定存在于血液循环中，是一种新兴的液体活检生物标志物。肿瘤外泌体与肿瘤的发生、发展关系密切，检测肿瘤外泌体特征蛋白水平比血清中游离蛋白的表达更可靠。然而，传统的外泌体蛋白分析方法普遍存在检测过程复杂、灵敏度低等问题。因此，开发新型的肿瘤外泌体蛋白分析方法，对其用于肿瘤诊断具有十分重要的意义。本论文以对外泌体表面肿瘤特征蛋白的认识为基础，利用表面等离子体共振技术及光子晶体信号放大的性质，设计了两种生物诊断芯片，实现肿瘤外泌体的特异性检测，为外泌体用于临床上早期癌症筛查提供新策略。具体研究内容和主要成果如下:<br>　　1、基于表面等离子共振的生物芯片用于PD-L1+外泌体检测<br>　　肿瘤外泌体表面PD-L1蛋白表达与肿瘤免疫治疗反应显著相关，针对外泌体表面糖基化的PD-L1蛋白难以检测的问题，本课题利用核酸适配体分子量小、可化学合成及易修饰等性质，设计了一种基于表面等离子共振(Surfaceplasmonresonance，SPR)的生物芯片用于PD-L1+外泌体灵敏检测（BiochipbasedonSPRforanalyzingExosomalPD-L1，SPR-ExoPD-L1）。PD-L1核酸适配体偶联至生物芯片表面，相比于抗体，适配体体积更小，易于识别检测糖基化的PD-L1蛋白。适配体特异性识别外泌体PD-L1膜蛋白，捕获PD-L1+外泌体，引起SPR芯片表面质量增加，导致折射率发生变化，产生SPR信号。SPR信号与PD-L1+外泌体浓度呈正相关，实现PD-L1+外泌体的灵敏检测。PD-L1适配体与外泌体之间具有很强的亲和力，常数为7.98nM。SPR-ExoPD-L1检测范围广，可分析浓度在0.63～7.50nM范围内的外泌体，检测限为44.50pM。该方法可将PD-L1+外泌体与PD-L1-外泌体区分开。与酶联免疫吸附试验的商业化试剂盒相比，该方法能更好地区分PD-L1表达水平不同的黑色素瘤细胞来源的外泌体，可能为临床上外泌体作为液体活检标志物用于癌症免疫疗效评估提供一种新策略。<br>　　2、基于仿生周期性纳米结构的信号放大诊断芯片用于肿瘤外泌体检测<br>　　从癌症早期阶段，肿瘤外泌体数量相对较少的问题出发，本课题开发了一种基于光子晶体的信号放大诊断芯片(Diagnosticbiochipbasedonphotoniccrystals，DBPCs)，实现GPC1+肿瘤外泌体的超灵敏和特异性检测。利用量子点标记的GPC1抗体特异性识别外泌体膜表面GPC1蛋白，然后借助光子晶体的信号放大能力实现肿瘤外泌体的超灵敏检测。制备的光子晶体芯片能特异性反射发射波长在525nm左右的光，且具有信号放大的作用;在优化的参数（聚苯乙烯球稀释比例、量子点与抗体结合比例、反应温度和时间等）下，DBPCs具有良好的动态检测范围(1.00×107～1.00×109particles/mL)，检测限低至4.00×106particles/mL。DBPCs不仅能将胰腺癌细胞系Panc-1外泌体与正常细胞系MCF10A外泌体区分开，还能将胰腺癌细胞系Panc-1外泌体与黑色素瘤细胞系B16F10外泌体区分开。此外，该方法也可检测复杂样本中的外泌体，能成功区分模拟的胰腺癌血清样本和非癌血清样本。DBPCs可通过改变标志物来定量分析其他疾病外泌体上的特征标志蛋白，为实现外泌体作为液体活检生物标志物用于临床肿瘤诊断提供新思路。