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摘要研究背景与目的:<br>　　目前针对晚期结直肠患者的治疗药物包括细胞毒性化学药物及一些分子靶向药物等，这些治疗药物的机制主要为诱导肿瘤细胞凋亡。但晚期结直肠癌患者预后不良，肿瘤在化疗之后依然能够在一定程度上存活，这与肿瘤耐受细胞凋亡有很大关系。找到一种能够绕过凋亡抵抗的治疗方式有望显著地降低结直肠癌治疗的失败率。AKT激酶是一种丝/苏氨酸激酶，广泛参与肿瘤的发生、存活、增殖、转移。靶向抑制AKT激酶可以引起肿瘤细胞死亡，但此过程中除了细胞凋亡之外是否还有其他细胞死亡方式的参与还并不清楚。因此，我们试图探索抑制肿瘤细胞内的AKT后，会触发何种细胞死亡方式，并研究相关分子机制。在本研究中，我们首次发现抑制AKT激酶活性，可以诱导结直肠癌细胞通过AKT/p53/SIRT6通路，发生PARP1依赖性细胞死亡(parthanatos)，并明显抑制结直肠癌细胞的生长。Parthanatos是一种不同于细胞凋亡的新型调节性细胞死亡方式，其发生需要PARP1(Poly [ADP-Ribose] polymerase 1)的高度激活，进而催化PARpolymer的生成，介导AIF向细胞核转位，最终引发细胞死亡。为实证我们的发现，我们将具体论述发现AKT抑制后触发Parthanatos的过程，探究AKT、p53、SIRT6及PARP1等分子之间的调控关系，明确AKT抑制所诱发的Parthanatos在结直肠癌治疗中的潜在价值。<br>　　研究对象和方法:<br>　　1.通过CCK-8实验检测AKT抑制剂对结直肠癌细胞系HCT-116活力的影响，以及联用凋亡抑制剂(caspase抑制剂)后细胞活力的改变。抑制AKT后检测氧化自由基(ROS)的生成情况。<br>　　2.在HCT-116中敲低AKT或使用AKT抑制剂后，通过WesternBlot实验检测坏死性凋亡，焦亡，铁死亡，自噬以及Parthanatos的分子标志物。免疫荧光染色，通过激光共聚焦显微镜观察Parthanatos的分子标志物PARpolymer的生成情况，AIF的细胞内定位情况。<br>　　3.AKT抑制剂联用PARP1抑制剂处理HCT-116后，通过CCK-8实验检测结肠癌细胞活力的改变;通过WesternBlot实验和免疫荧光染色检测Parthanatos的分子标志物;通过流式细胞技术检测细胞死亡情况。<br>　　4.检测AKT抑制后p53的表达情况，通过CCK-8实验检测p53野生型(wt)和p53敲除(-/-)的HCT-116细胞系对AKT抑制剂的敏感性差异;在p53wt和p53-/-的HCT-116中分别抑制AKT后，通过分离提取线粒体、细胞质、细胞核蛋白，WesternBlot实验和免疫荧光染色检测Parthanatos的分子标志物;向HCT-116p53-/-细胞系转染p53过表达质粒后，检测AKT抑制对PARpolymer的生成的影响;检测多种p53野生型和p53突变型肿瘤细胞，在抑制AKT后的PARpolymer的生成情况的差异。<br>　　5.检测AKT抑制对SIRT6表达的影响;检测过表达SIRT6对AKT抑制诱导的PARpolymer生成，和细胞活性的影响。通过CO-IP实验检测p53与SIRT6、p53与PARP1的相互作用关系。<br>　　6.通过皮下注射p53wt和p53-/-的HCT-116细胞，建立裸鼠体内实验模型。使用AKT抑制剂处理15天后，测量各组切取的肿瘤体积和重量;通过WesternBlot实验和免疫组化实验验证切取肿瘤中相关分子表达水平的变化。<br>　　7.通过WesternBlot实验和免疫组化实验检测PARP1、PARpolymer、p53、SIRT6在人源结直肠癌组织和癌旁组织的水平。<br>　　研究结果:<br>　　1.抑制AKT显著降低结直肠癌细胞活力，促进ROS生成;联用caspase抑制剂后细胞活力部分回升。<br>　　2.抑制AKT可引起PARpolymer的生成和促进AIF从线粒体向细胞核转位，即诱发Parthanatos。<br>　　3.抑制AKT后，p53野生型的肿瘤细胞会发生Parthanatos，而p53敲除细胞或突变细胞则不会发生Parthanatos。<br>　　4.过表达SIRT6可以促进AKT抑制诱导的PARpolymer的生成，并促进AKT抑制剂的肿瘤杀伤作用。<br>　　5.内源性/外源性CO-IP结果显示，p53与SIRT6之间、p53与PARP1之间存在相互作用。<br>　　6.体内实验验证了AKT抑制诱导的Parthanatos需要p53的参与。<br>　　7.相较癌旁组织，p53、PARP1的表达在肿瘤中较高，PARpolymer、SIRT6的表达在肿瘤组织中较低。<br>　　结论:<br>　　抑制AKT可以通过p53/SIRT6/PARP1通路引起结直肠癌发生Parthanatos，促进结直肠癌细胞死亡。ROS的生成也可能参与AKT抑制诱导的Parthanatos这一过程。肿瘤组织中PARpolymer水平较低，说明Parthanatos这一细胞死亡通路在结直肠癌中未被激活;而p53、PARP1表达水平高，说明诱导Parthanatos的发生在结直肠癌中具备分子基础。应用AKT抑制剂诱导的Parthanatos可能成为晚期结直肠癌治疗中，克服细胞耐药，提高治疗敏感性的潜在方式。