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摘要代谢重塑(metabolicremodeling)是肿瘤的重大特征之一。肿瘤细胞通过代谢重塑以应对营养物质匮乏的危机、加强对可及的能量物质的利用效率，以满足肿瘤细胞快速增殖的能量和物质需求。在代谢重塑的过程中，肿瘤细胞往往会形成对特定代谢通路的生存依赖，称为肿瘤的代谢依赖性或代谢弱点(metabolicvulnerability)。基于这一认识，靶向肿瘤的代谢依赖性为肿瘤的靶向治疗提供了新的契机，成为肿瘤治疗的新的热点研究领域，为尚无药物治疗的难治性肿瘤提供了新的探索方向。与此同时，针对肿瘤代谢依赖性的治疗策略面临着诸多挑战。一方面肿瘤的代谢特征具有显著的异质性，但是大多数的肿瘤代谢依赖性并不清楚，靶向代谢的治疗大多缺乏指导;此外，肿瘤细胞表现出较强的代谢可塑性（metabolicplasticity），在代谢抑制剂作用下极易导致代偿代谢通路的激活。因此，从代谢重塑的机制出发，认识不同肿瘤代谢依赖性的成因并发现肿瘤代谢可塑性的特征，对于指导针对代谢的肿瘤靶向治疗，提出新的治疗策略，具有重要意义。<br>　　癌基因激活是肿瘤中最常见的代谢重塑机制之一，目前的认识还非常有限。特别值得注意的是，癌基因异常已经成为当前指导多种肿瘤临床药物治疗的分子分型依据，认识癌基因驱动肿瘤的代谢弱点和分子机制，将有望实现基于临床分子分型的肿瘤代谢个性化治疗。在本论文中，我们选择具有显著癌基因驱动特征的非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)，针对KRAS驱动肿瘤尚无有效药物治疗的困境，探索KRAS驱动肿瘤的代谢依赖性的差异及肿瘤代谢可塑性的规律，为KRAS突变肿瘤的抗代谢治疗提供线索。此外，我们还在前期机制研究的基础上，探索了以受体酪氨酸激酶家族EGFR和FGFR癌基因异常为分型依据，指导肿瘤代谢个性化治疗的可行性。<br>　　本论文的第一部分探索了KRAS驱动NSCLC的代谢依赖性。KRAS是NSCLC中突变率最高的癌基因之一。靶向KRAS蛋白的药物研发由于KRAS蛋白自身难以靶向等问题，一直面临极大挑战。近年来靶向个别突变形式的小分子药物研发初见曙光，但是大多数KRAS突变肿瘤可能在未来相当一段时间内仍面临无药可用的局面。发现KRAS驱动NSCLC的代谢弱点，有望为KRAS突变肿瘤的治疗带来突破。为了认识KRAS突变肿瘤的代谢特征，我们聚焦了KRAS突变肿瘤对细胞重要的能量物质之一谷氨酰胺（glutamine，Gln）的依赖性。使用多株KRAS突变的NSCLC细胞为研究模型，结合公共数据库信息和实验研究发现，KRAS突变的NSCLC细胞株呈现出对Gln增殖依赖性的显著差异，与此同时，细胞对另一关键能量物质葡萄糖(glucose，Glc)的代谢则显示出较高的一致性，提示对Gln依赖性的研究，有望深入认识KRAS驱动肿瘤的代谢异质性。为了探索Gln依赖性差异原因，我们对依赖（Gln-dependent）和非依赖(Gln-independent)的两群细胞的代谢组学数据进行相关性分析以及通路富集。结果显示，多条氨基酸代谢通路被富集，其中，丙氨酸(alaine，Ala)、丝氨酸和甘氨酸代谢通路与Gln增殖性呈正相关;而β-Ala和谷胱甘肽代谢通路与Gln增殖性呈负相关，提示细胞的氨基酸代谢差异可能造成细胞对Gln依赖性的差异。进一步检测Gln缺乏前后细胞中各种氨基酸含量的变化，发现在非依赖细胞中Ala水平显著下降，而依赖细胞则无显著变化。结合以往代谢通路认识，我们分析Gln供给谷氨酸（glutamate，Glu）与Ala转氨代谢的差异，即谷丙转氨平衡可能是导致细胞Gln依赖性不同的原因。<br>　　进一步，以谷丙转氨平衡为线索，我们分析了Gln依赖和非依赖群体的代谢特征。研究发现，在Gln依赖细胞中，Gln向Ala的转化相对较弱，细胞内Ala浓度和Ala代谢酶的关键酶谷丙转氨酶（glutamic-pyruvictransaminase，GPT2）的表达水平均显著低于非依赖群体，提示Gln可能流向另一支路，供给谷胱甘肽(glutathione，GSH)合成。与这一猜想一致，采用13C-Gln标记示踪Gln的代谢流向，发现在Gln依赖细胞中，Gln代谢为GSH的比例显著高于非依赖细胞。同时，GSH合成通路代谢酶，包括谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位（glutamate-cysteineligasecatalyticsubunit，GCLC）和谷胱甘肽合成酶(glutathionesynthetase，GSS)的表达量显著增加。GSH合成是维持细胞氧化还原平衡的重要通路，检测Gln缺乏对细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)水平的影响，发现Gln依赖细胞内ROS水平显著升高，而抗氧化剂N乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)可以降低细胞对Gln的依赖性。我们据此推测，Gln缺乏时，因为Ala不能补给Gln，细胞GSH合成减少，氧化还原失衡。与上述认识一致，对细胞补给Ala，可逆转ROS和细胞对Gln缺乏的增殖依赖，且细胞对Gln代谢抑制剂敏感。为了揭示Gln非依赖细胞如何利用Gln，我们采用稳定同位素13C全碳标记的Gln对Gln缺乏刺激的细胞进行代谢流标记，以凸显不同肿瘤细胞对Gln需求情况。结果表明，Gln在大量生成Ala的同时，伴随产生大量α-KG，可流向线粒体三羧酸循环(tricarboxylicacidcycle，TCAcycle)。进一步通过分析TCA循环中间产物柠檬酸的不同代谢型，即指征还原羧化的M5和氧化脱羧的M4的比例发现，非依赖细胞的Gln还原羧化较强，提示细胞的脂肪酸合成能力强。与该结果一致，Gln非依赖细胞中缺乏Gln时，脂肪酸合成相关酶ATP柠檬酸裂解酶(ATPcitratelyase，ACLY)、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoAcarboxylase，ACACA）、脂肪酸合成酶（fattyacidsynthase，FSAN）、酰基辅酶A合成酶(acyl-CoAsynthetases，ACSL)水平下调，转向增强脂肪酸氧化代谢。与这一认识一致，Gln缺乏时细胞内的脂肪酸水平显著下调。这一结果提示，Gln缺乏条件下合成代谢向分解代谢的转变可能是保证其存活的代谢重塑关键。基于这一认识，联合抑制谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS)和脂肪酸氧化关键酶能协同抑制Gln非依赖细胞增殖，克服了细胞对Gln代谢抑制不敏感的现象。<br>　　我们进一步对Gln依赖性差异的调控机制进行探索。考虑到KRAS调控多条下游磷酸化信号通路的激活，我们猜测是否是不同细胞内信号通路激活情况的差异驱动了两类细胞在Gln缺乏时产生不同的代谢重塑表型。因此，我们对Gln依赖细胞进行磷酸化蛋白质组检测和差异蛋白通路富集分析，发现mTOR通路受Gln缺乏影响显著下调。基于mTOR与Gln代谢的紧密联系及其与KRAS信号的紧密联系，我们重点关注mTOR通路受Gln影响情况。我们发现Gln依赖和非依赖群体的mTOR通路受Gln缺乏影响存在差异。进一步，我们发现抑制mTOR通路可以减弱KRAS突变细胞的Gln代谢，削弱Gln非依赖细胞的脂肪酸合成方向代谢流向和代谢酶表达，增加Gln依赖细胞的GSH合成酶表达。以上结果提示了mTOR通路与Gln代谢的反馈调节方式，是造成Gln增殖依赖性差异的调控机制，证实了Gln依赖细胞对mTOR抑制剂高度敏感。<br>　　本论文的第二部分是在组内前期的研究工作基础上展开。前期研究聚焦NSCLC中突变的癌基因EGFR和FGFR，通过系统研究发现，EGFR突变NSCLC细胞主要依赖丝氨酸合成通路，而FGFR扩增NSCLC细胞依赖乳酸合成。本论文进一步在治疗学角度探索EGFR和FGFR作为代谢酶抑制剂敏感标志物的可行性。我们将工具细胞株所得结论拓展到大规模肿瘤细胞、细胞株移植瘤模型和病人来源的移植瘤模型，在多个含有EGFR突变和FGFR扩增或野生型的模型中，证实丝氨酸合成通路限速酶磷酸甘油酸脱氢酶(phosphoglyceratedehydrogenase，PHGDH)抑制剂对EGFR突变肿瘤具有更好的治疗疗效;而乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)抑制剂则仅对FGFR扩增肿瘤有效，提示EGFR突变和FGFR扩增分别是PHGDH和LDH抑制剂的敏感标志物，有望实现临床分子分型指导的代谢抑制剂的个性化治疗。<br>　　综上，本论文重点围绕KRAS驱动的NSCLC，基于Gln增殖依赖性差异，发现细胞Ala和脂肪酸储备，是造成细胞代谢可塑性对Gln代谢抑制剂不敏感的关键因素，主要受mTOR通路调控。本论文的发现揭示了KRAS驱动NSCLC的代谢依赖性差异及其调控机制，为KARS驱动NSCLC的靶向代谢治疗提供理论基础，并为NSCLC分子分型指导肿瘤代谢抑制剂的敏感群体选择和个性化治疗提供了重要的依据。