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摘要糖尿病视网膜病变（糖网）是糖尿病的常见并发症之一，约有三分之一的糖尿病患者伴有糖网，也是这类患者的主要致盲因素。抗VEGF疗法是如今临床上应用最为广泛的治疗手段，但抗体药物半衰期短，需要频繁眼内注射，给患者带来极大的痛苦并且会增加患者继发性白内障的患病风险。因此，新的治疗手段开发亟待解决。基因治疗是指通过导入外源基因或非编码序列，来纠正或补偿靶细胞内异常基因及其表达从而达到治疗疾病的目的。这种治疗方法虽然也需要眼内注射的方式，但以病毒为载体的基因治疗可以使外源基因或纠正异常表达基因的非编码序列在体内持续释放，无需频繁干预，减轻了患者的治疗痛苦，大大提高了患者的依从性，因此基因治疗是糖网治疗手段开发的重要方向。<br>　　由于如今糖网动物模型及检测技术大多用于基础科研，用于糖网基因治疗临床前评价体系的动物模型较少，动物模型检测、眼内药物递送等技术手段仍不够完善。本课题旨在通过分子生物学、组织学等多种实验技术，分别建立体外糖网血管内皮通透性模型和体内动物模型，并且进行多种检测技术条件和实验方法的优化，为糖网临床前成药性检测和评价提供科学可靠的技术平台。<br>　　体外糖网血管内皮通透性模型建立:1、血管内皮通透性模型:本课题首先在体外建立了两种血管内皮细胞通透性模型，通过小室培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、小鼠脑微血管细胞(MBMEC)，并给予重组VEGF刺激，建立了体外糖网血管内皮通透性模型。2、荧光葡聚糖穿膜实验条件优化:本课题利用荧光葡聚糖穿膜实验进行血管内皮通透性检测。通过对细胞数量、刺激条件、刺激时长的优化，得到了3×104个HUVEC、6×104个MBMEC为最佳的血管内皮通透性检测细胞数、48小时为最佳刺激时间。结果表明，体外血管内皮通透性模型建成。<br>　　体内糖网基因治疗临床前成药性评价动物模型建立:本课题在体内分别建立了三种动物模型，其中两种为糖网疾病动物模型，一种为眼内小核酸递送动物模型，并通过不同的检测技术对动物模型进行检测。<br>　　1、动物模型的建立及检测:(1)高氧诱导糖网模型:首先，本课题建立了高氧诱导小鼠模型，将出生7天的C57乳鼠放入75％氧浓度的氧箱中饲养5天，出氧箱后继续饲养5天后取小鼠视网膜进行检测。检测结果显示，与对照组相比，高氧诱导小鼠视网膜血管异常增生，且高氧诱导小鼠视网膜中VEGF基因表达量上调，磷酸化STAT3表达量上调。因此，结果表明高氧诱导小鼠糖网模型建立成功。<br>　　(2)Akita小鼠糖网模型:本课题引入了胰岛素2基因(Ins2)突变的Akita糖网模型，并进行自行繁育及基因型鉴定，在繁育至第三代时进行糖网检测。检测结果表明，与野生型小鼠相比，Akita小鼠视网膜中视锥视感细胞及视网膜神经节细胞功能受损、视网膜结构损伤、视网膜血管出现多处渗漏，这些结果均与糖网病理特征一致。因此，结果表明Akita小鼠糖网模型验证成功。<br>　　(3)眼内小核酸递送动物模型:本课题利用慢病毒及腺相关病毒作为体内递送载体，分别进行眼内小核酸（目的基因siRNA）的递送，并且进行了效果的检测与比较。结果表明，慢病毒注射3周后，目的基因表达量没有下降趋势，因此，该慢病毒不适合于眼内小核酸的递送。腺相关病毒注射3周目的基因表达未见明显变化但有下降趋势，注射8周后可检测到目的基因表达量降低。因此，结果表明该腺相关病毒适合于体内小核酸的递送，基于腺相关病毒体系的眼内小核酸递送动物模型建立成功。<br>　　2、检测技术优化及应用:(1)离体糖网检测技术:本课题通过对视网膜铺片血管染色、视网膜组织免疫荧光实验中固定条件及染色时间的优化，得到可用于动物模型离体检测的最佳实验条件，并成功将这些技术应用于高氧诱导糖网模型的检测。(2)体内糖网检测技术:本课题通过对视网膜电图(ERG)实验中发光时间及光强的摸索、视网膜断层扫描(OCT)实验中扫描位置的优化、体内荧光葡聚糖渗漏实验中灌注方式及剂量的优化，得到了可用于小鼠糖网体内检测的实验条件，并将这些实验手段成功应用于Akita糖网小鼠的检测。(3)病毒制备与体内病毒感染检测技术:本课题通过对病毒包装、浓缩条件的优化，病毒体内感染及检测实验技术条件的优化，得到了可用于眼内小核酸递送的病毒制备实验条件，并成功应用于慢病毒和腺相关病毒的制备;同时，本课题通过对体内小鼠眼底荧光造影、离体小鼠视网膜RNA抽提等技术条件的优化，得到可用于病毒感染及基因表达量检测的实验技术条件，并将这些技术成功应用于眼内小核酸递送动物模型的建立和检测。<br>　　综上，本课题利用多种分子生物学、组织学技术方法，建立了体外糖网血管内皮通透性模型、体内糖网疾病动物模型以及基于腺相关病毒体系的眼内小核酸递送动物模型，成功建立了糖网基因治疗临床前成药性检测技术平台。同时，本课题进一步优化了体外荧光葡聚糖穿膜实验条件，优化了视网膜铺片、免疫荧光、ERG、OCT、眼底荧光造影等多种糖网疾病动物模型检测技术，并将这些技术成功应用于糖网模型小鼠的检测。此外，本课题还利用新的小核酸序列成功检测了基于腺相关病毒的眼内小核酸递送系统。本课题建立的糖网基因治疗临床前成药性评价技术平台，可应用于糖网治疗策略的开发，为糖网药物临床前成药性检测提供了切实可行的评价体系。