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摘要近年来随着耐药细菌和超级耐药细菌的增多，多粘菌素已经开始被全球科学家公认为能够抗击革兰氏阴性菌的最后一道屏障。然而伴随这种抗生素在畜牧业、农业甚至医疗产业中使用率的逐年增高，越来越多的细菌对于这种抗生素的耐药性也慢慢显现出来。2015年底在中国首次发现的mcr-1基因可以编码一种锚定在细胞质膜上的磷脂酰乙醇胺转移酶，该转移酶可以对细胞膜上的lipid A分子进行修饰，从而阻断多粘菌素对于革兰氏阴性菌细胞膜的破坏，导致多粘菌素丧失杀死细菌的能力。与这种MCR-1转移酶类似的，2016年在比利时发现的MCR家族新成员MCR-2也具有同样的多粘菌素耐药功能。然而，由于MCR家族蛋白都属于细胞膜表面的转移酶蛋白，其结构有将近一半属于跨膜结构域，因此目前对这种膜蛋白的全长蛋白结构与转移酶机制研究还不是很多。<br>　　为此，本篇论文的第2章着重对MCR-2全长蛋白结构及其与底物小分子结合的机制进行研究。通过X射线晶体学手段成功解析了MCR-2蛋白酶活中心结构域的晶体结构。从结构中清晰地看到了酶活作用中心的关键氨基酸位点，并通过体内与体外多个酶活验证实验对该作用中心进行了生化验证，确定了酶活中心关键位点在底物催化作用中的重要功能。与此同时，通过进一步的同源结构模拟，我们找到了可能结合底物分子的孔洞位置，并通过对该孔洞周围关键氨基酸位点的点突变实验，结合体内体外的生化实验数据，最终确定了六个可能参与结合固定底物分子的重要氨基酸位点。综上所述，这项研究阐明了MCR-2催化底物的作用机制，揭示了MCR-2蛋白在多粘菌素耐药过程中发挥的重要分子机制，为后面进一步的耐药性研究和小分子抑制剂的设计奠定了理论基础。<br>　　结核分枝杆菌是一种能够引发哺乳动物呼吸系统感染结核病的重要致病菌。全球每年因结核分枝杆菌感染结核病的病例多达1000万例，而其中因结核病死亡的病例约占到总人数的15％（数据截止到2019年10月17日）。面对这样严峻的感染形势，世界各国的科学家与医务工作者都密切关注着对于这种细菌致病机理的相关研究进展。近些年人们发现在结核分枝杆菌中存在一种其他革兰氏阴性菌中不曾见过的新型分泌系统，Ⅶ型分泌系统。这种分泌系统被发现是结核分枝杆菌重要的毒力因子运输通道，它可以将很多结核菌细胞内合成的小分子多肽或高免疫原性蛋白运输到其复杂的细胞壁结构之外。在近几年最新的Ⅶ型分泌系统研究中还发现，这种分泌系统可能也与结核杆菌发挥耐药机制相关，尤其是其中的EccB和EccD蛋白很可能与多种抗生素分子的耐药性存在关联。因此，研究Ⅶ型分泌系统的运输机制对于破解结核杆菌的致病机理及其耐药机制可起到关键作用。<br>　　Ⅶ型分泌系统又称为ESX分泌系统。ESX分泌系统可分为ESX-1，ESX-2，ESX-3，ESX-4，ESX-5五种亚型。其中从系统生物学分析和致病菌分类角度研究可以发现ESX-4型基因簇是进化上最早发生的，此后才逐步产生了ESX-3，ESX-1，ESX-2和ESX-5。在目前研究较多的ESX-1型分泌系统中，发现能够参与该系统分泌与转运作用的相关蛋白约有18种。其中比较重要的组成分泌系统结构的蛋白包括有EccB，EccC，EccD，EccE，MycP1等若干种蛋白。EccB，EccC，EccD，EccE几种蛋白在蛋白质二级分析中都发现存在跨膜结构区域，说明这几种蛋白可能是组成细胞质膜上蛋白进出的重要孔洞复合物。在这几种膜蛋白中EccD的跨膜结构域最多，这说明该蛋白很可能就是直接介导小分子毒力因子进出的直接相互作用分子。因此，在整个ESX-1分泌系统的研究中，对EccD蛋白结构与功能的研究，和该蛋白与其他组成蛋白或小分子的相互作用的研究就显得尤为重要。<br>　　在本篇论文的第3章中我们通过对结核杆菌的Ⅶ型分泌系统重要的跨膜蛋白EccD及其类似同源蛋白的研究，探究了EccD这种跨膜蛋白在体外溶液中的聚集形式，纯化条件方式，以及适宜的去垢剂溶液环境等，最终确定了结核分枝杆菌的EccD蛋白是一种可以通过体外异源表达大量纯化得到的重要膜蛋白，同时提示了这种蛋白通过筛选蛋白质结晶条件得到膜蛋白晶体的可能性，可以为后面进一步研究该蛋白结构以及转运毒力因子作用区域提供重要的理论依据。