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摘要新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus2，SARS-CoV-2)的大流行标志着第三种高致病性冠状病毒（其余分别为Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus1,SARS-CoV-1和Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus，MERS-CoV)的出现。在过去的二十年中，冠状病毒引起了三起大规模爆发:严重急性呼吸道综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)和现在的2019年冠状病毒病(Coronavirus Disease2019，COVID-19)。COVID-19首例病例在2019年12月1日出现症状，随后出现了人与人之间的快速传播和洲际传播，并于2020年3月被世界卫生组织(World Health Organization，WHO)宣布为大流行病。此后，在235个国家、地区传播流行起来。尽管SARS-CoV-2的致死性不如SARS-CoV-1或MERS-CoV，但SARS-CoV-2具有高度的易传播性。<br>　　冠状病毒科的SARS-CoV-2新冠病毒是有包膜，正义单链的RNA病毒，属于β型冠状病毒属，SARS-CoV-2基因组序列与SARS-CoV-1具有约80％的序列同源性，与MERS-CoV具有约50％的序列同源性。患者通常表现为严重肺炎的呼吸样疾病，表明肺是SARS-CoV-2的主要嗜性器官，并且发现SARS-CoV-2和SARS-CoV-1一样都结合相同的受体血管紧张素转化酶2(Angiotensin converting2，ACE2)来感染受体细胞。本研究于2020年2月份获得治愈的新冠患者的恢复期血样后，综合运用生物化学、分子生物学、免疫学、细胞生物学、结构生物学及临床医学等技术手段全面揭示了SARS-CoV-2新冠病毒感染机体康复后，体内受体结合结构域(Receptor Binding Domain，RBD)特异抗体的性质图谱全景，鉴定出识别RBD的6类中和抗体群，阐明6个中和表位区的中和能力与空间识别位点的关系，验证了6个不同表位区的中和机制，并设计了一类具有诱导机体产生交叉中和SARS-CoV-2和SARS-CoV-1病毒的RBD免疫原。<br>　　首先，本研究建立了32名COVID-19康复者的临床队列，获取了康复者的临床症状信息，并收集了康复者的外周血血浆和单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)标本，从中随机挑选了10名康复者，对其外周血血浆测试了结合RBD蛋白的总抗体、IgG及IgM亚型抗体的相对滴度水平，并进一步利用VSV的假病毒中和平台，测试了10位康复者血浆中和假病毒感染受体细胞的能力，结果显示10位康复者的血浆均能够有效地中和假病毒对受体细胞的感染，在100倍的稀释滴度下均能中和50％的病毒感染，康复者能够产生中和新冠病毒的强免疫能力。在血浆特异抗体结合活性水平与中和能力的分析中，总抗体及IgG抗体结合活性与中和能力之间存在明显的相关关系，表明SARS-CoV-2康复者体内总抗体和IgG亚型抗体可能在一定程度上发挥着重要的中和效应。利用流式平台建立了SARS-CoV-2RBD特异的记忆B细胞染色分析方案，为SARS-CoV-2RBD特异性抗体筛选提供了研究基础，我们从10位新冠康复者体内获得了77株SARS-CoV-2RBD特异的抗体，其中67株为独特克隆RBD特异抗体。<br>　　其次，本研究对获得的67株独特克隆的RBD特异抗体开展进一步的性质图谱研究。分析特异抗体可变区序列，了解康复者体内特异抗体的家系使用来源，并对获得的所有特异单克隆抗体进行全面的新冠抗原结合活性鉴定。利用VSV的假病毒中和模型评价所有特异抗体中和病毒感染受体细胞的能力强弱。此外，不同于抗体中和能力的测试，我们借助荧光标记的S蛋白探针，能够检测特异抗体阻断S蛋白结合受体细胞ACE2蛋白的能力，强阻断能力的抗体在很大的程度上可能显示出与ACE2与S蛋白结合表位的重叠。发现67株SARS-CoV-2RBD特异抗体中有33株(33/67，49.25％)均为能够交叉结合SARS-CoV-1S蛋白的抗体，有43株(43/67，64.18％)抗体均能产生不同程度的阻断反应，并发现67株抗体中有52株(52/67，77.62％)抗体能够中和SARS-CoV-2假病毒对受体细胞的感染。在52株能够中和SARS-CoV-2假病毒感染的抗体中，仅有3株具有交叉中和SARS-CoV-1假病毒的能力。交叉阻断结果显示从10位康复者分离出来的单克隆中和抗体群依据相对的空间位置信息，可以将之分为6类中和表位区(S1-S6)。进一步结合各个抗体群中代表性抗体与含有氨基酸突变的RBD重组蛋白库的反应性图谱，实现对6个抗体群的潜在识别表位进行氨基酸定位，结果显示出识别S1、S5和S6表位的抗体，识别氨基酸定位于SARS-CoV-2RBD蛋白的17个残基与ACE2蛋白的20个残基接触的交互作用界面上，抗体识别S1、S5和S6中和表位区的氨基酸位点位于ACE2的N端螺旋与RBD相互作用界面（包括了α4、β5、β6和α5这段核心受体结合基序），这个区域共有17个ACE2的残基与RBD作用。含有氨基酸突变的RBD重组蛋白库分别鉴定出S2、S3中和表位区抗体的5个和1个氨基酸识别位点，S2表位区其中2个残基位于N端螺旋与RBD相互作用界面，3个残基位于RBD蛋白β2、β3、α2和α3肽段，此肽段不与ACE2相互作用，S3表位区的1个残基与S2表位区的β2段重叠。识别S4表位区抗体的1个氨基酸识别位点是位于ACE2与RBD相互作用的核心结合基序中，但该位点处于RBD域β5和β6之间朝相反方向远离二者相互作用界面的长Loop区，提示S4表位区可能具有独特的中和机制。以上信息有助于应对突变发生后可能的免疫逃逸现象，并为研发疫苗的有效性提供重要的理论指导。<br>　　本研究通过获得的6类中和抗体群的性质图谱信息，证明了它们在性质上有各自不同的特征，也提示我们SARS-CoV-2和SARS-CoV-1病毒有不同的免疫原性。鉴于中和抗体识别的S2、S3和S4表位区在SARS-CoV-2和SARS-CoV-1病毒的RBD域上更为保守，特别其中识别S2表位区的抗体群具有良好的中和能力，但识别该表位区的抗体群数量较少，提示在天然免疫原上S2表位为非优势表位。天然免疫原上的优势中和表位为S1表位区，识别该表位区的抗体普遍显示出明显的SARS-CoV-2倾向性，序列分析也显示该表位区氨基酸具有较高的突变频率。以上表位信息为我们设计出能诱导机体产生交叉中和抗体的新型免疫原和冠状病毒广谱疫苗提供了重要信息。初步设计出了两类诱导交叉中和抗体的RBD免疫原，一类是直接截断掉S1表位区的部分多肽段，第二类是采用糖基化的手段去掩盖RBD蛋白上的优势表位S1。以上的设计目的均是弱化S1优势表位的暴露，从而凸显出更具保守性非优势S2-S4表位区，从而诱导出交叉中和抗体的产生。动物免疫结果显示:新型免疫原能够有效的诱导出35％左右比例的交叉中和抗体，天然免疫原几乎不能诱导出交叉中和抗体。<br>　　综上所述，本研究通过分离10位新冠病毒康复者体内的SARS-CoV-2RBD特异记忆B细胞从而实现抗体的体外扩增，从分子水平详细描绘了特异抗体的性质图谱，包括结合活性、阻断活性、中和活性、相对空间位置信息和识别的关键氨基酸位点。阐明了RBD结构域是作为中和SARS-CoV-2新冠病毒感染受体细胞的重要靶点，并展示出RBD特异的6类中和抗体表位区在RBD蛋白三级结构上的空间位置。建立了诱导交叉中和SARS-CoV-2和SARS-CoV-1病毒的新型免疫原。这些发现为机体感染SARS-CoV-2新冠病毒后遗传B细胞库所产生的免疫应答谱提供了重要的理论揭示，丰富了SARS-CoV-2新冠病毒构象变化、感染结合、融合入胞和中和机制等基础病毒学理论。其中基于SARS-CoV-2和SARS-CoV-1RBD序列同源性差异以及6类中和抗体表位区信息，建立了高效诱导交叉中和SARS-CoV-2和SARS-CoV-1病毒的新型免疫原，该免疫原及其设计思路可以为未来冠状病毒广谱疫苗的开发提供重要的指导理论基础。