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摘要Valosin-containing protein(VCP/p97)作为哺乳动物细胞中一种重要的ATP酶，高度参与细胞内多种通路。例如，它能通过水解ATP发挥自身的去折叠酶活性或者分离酶活性，负责把泛素化的底物从膜上或者大分子复合物分离出来，并通常转运至胞质中的蛋白酶体进行降解。膜蛋白作为其主要底物之一，目前并不清楚是如何被VCP/p97介导从生物膜内分离的。<br>　　为了研究VCP/p97是否能直接将TMD拖拽出膜，首先在体外重构了VCP/p97促进介导泛素化底物去折叠的方法，课题分为两部分:第一部分选择合适的体外底物并进行体外泛素化，第二部分则是验证并重构VCP/p97介导的去折叠活性。在第一部分实验中，首先选取天然绿色荧光蛋白GFP或光转换蛋白mEOS3.2作为模式底物，当折叠状态改变，发光团被破坏后，荧光值就会有所下降。在其N端进行改造后使其能够被泛素连接酶识别，并在体外进行泛素化，然后分离纯化得到带有K48长链泛素的荧光蛋白。接下来在第二部分实验中，将VCP/p97、辅助因子UFD1/NPL4、ATP等加入带有长链泛素化荧光底物的体系里，并立即检测激发光下的发射光值变化。结果表明，VCP/p97在UFD1/NPL4的帮助下能够对荧光蛋白进行去折叠，荧光值有明显下降。此外，在体系中加入VCP/p97的抑制剂CB5083或不加ATP，发现其荧光没有明显改变，进一步佐证了在该体系中VCP/p97主要是通过发挥ATP酶活性对底物进行去折叠的。<br>　　结合以上两部分结果证明，在体外成功重构了VCP/p97-UN复合物对带有长泛素底物的去折叠酶活性。以上建立的方法，可以成为体外研究膜蛋白出膜或大分子复合物分离的有效工具，后续为探究VCP/p97介导底物的具体机制、寻找或筛选相关因子奠定基础。