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摘要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotide，NAD+)是细胞内最重要的代谢产物之一，可作为反应底物或辅因子参与细胞物质合成、能量代谢、转录调控及DNA损伤修复等多种重要的生理过程。哺乳细胞内的NAD+主要通过补救途径合成，其中烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamidephosphoribosyltransferase，NAMPT)是NAD+补救合成途径的关键限速酶，能够催化烟酰胺(nicotinamide，NAM)生成NAD+的前体物质烟酰胺单核苷酸，后者再经由烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶催化合成NAD+。研究表明，NAMPT在多种肿瘤细胞中高表达，为肿瘤的快速增殖提供充足的NAD+。肿瘤细胞的NAMPT还能够以分泌形式(extra-cellularNAMPT，eNAMPT)分泌到细胞外，促进肿瘤的发生发展，但是相关的机制认识仍然非常有限。当前，靶向NAMPT逐渐成为抗肿瘤药物研发的热点方向之一，已有多个NAMPT酶活抑制剂进入临床研究阶段，然而临床研究结果显示其抗肿瘤效果非常有限，对该靶点的治疗突破亟需新的靶向策略。本论文旨在聚焦eNAMPT，深入认识eNAMPT促肿瘤的功能，探索NAMPT新型靶向策略，为NAMPT抑制剂的研发提供理论基础。<br>　　本论文第一部分初步探究了肿瘤细胞分泌的eNAMPT调节肿瘤免疫的机制。通过考察多株肿瘤细胞eNAMPT的分泌水平，发现绝大多数肿瘤细胞都能分泌eNAMPT，但不同细胞的分泌水平有显著差异，且与细胞内的NAMPT水平无显著相关性。选择eNAMPT较高水平的肿瘤细胞，干扰细胞内NAMPT的表达，发现对肿瘤细胞的增殖无显著影响，与NAMPT酶活抑制剂FK866的结果一致。进一步，接种稳定干扰NAMPT的小鼠肿瘤细胞到免疫健全的小鼠，发现肿瘤组织中免疫细胞浸润发生显著改变，主要表现为骨髓来源的抑制性细胞(myeloid-derivedsuppressorcells，MDSC)浸润比例的下降，并伴随着T细胞浸润的增加，且上述作用与肿瘤细胞分泌的eNAMPT水平具有一定的相关性。进一步使用NAMPT酶活抑制剂FK866则无显著影响，提示eNAMPT可能是通过非酶活功能影响肿瘤微环境的MDSC。在此基础上，我们探索了eNAMPT对MDSC的调节机制。通过直接外加NAMPT重组蛋白处理以及肿瘤细胞与MDSC的共培养的实验发现，eNAMPT能够激活MDSC扩增相关的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)和信号传导与转录激活因子3(SignalTransducerandActivatorofTranscription3，STAT3)信号通路，提示eNAMPT通过上述信号通路促进MDSC的扩增，发挥免疫逃逸作用。基于上述认识，我们与药化团队合作研发了能够降解NAMPT的小分子化合物NAMPT-PROTACA7，证实该化合物显著降低肿瘤细胞eNAMPT的水平，并阻断eNAMPT对MDSC的促扩增作用，抑制肿瘤生长，提示靶向eNAMPT在抗肿瘤研究中具有巨大潜力。<br>　　本论文第二部分基于NAMPT酶活抑制剂的联合用药策略，开展了相应双靶抑制剂的研究。首先，基于已有研究的提示，我们证实了DNA烷化剂与NAMPT酶活抑制剂具有协同抗肿瘤作用。据此，与药化团队合作，通过化学融合DNA烷化剂苯丁酸氮芥与NAMPT酶活抑制剂FK866，设计合成了双靶化合物F96。对F96的体外抗肿瘤活性进行评价，发现F96能够显著抑制肿瘤生长，表明双靶化合物与NAMPT酶活抑制剂相比具有显著的治疗优势。为了认识F96的抗肿瘤作用机制，我们在分子水平评价了F96对NAMPT酶活的影响。结果显示，F96能在分子水平降低细胞内NAD+水平，且活性与FK866相当，但在细胞内对NAD+水平的影响显著优于FK866。同步以γ-H2AX的蛋白水平作为评价指标，检测了F96对肿瘤细胞DNA损伤的诱导作用，结果显示F96能在药物作用24h后显著提高γ-H2AX的蛋白水平，提示发生了继发性DNA损伤。进一步研究发现，回补NAD+前体物质NMN提高NAD+水平能够逆转F96对肿瘤细胞的增殖抑制作用，提示F96的抗肿瘤作用机制与NAD+耗竭相关。更进一步，利用聚ADP核糖聚合酶(PolyADP-ribosePolymerase，PARP)抑制剂减弱细胞对NAD+的消耗，结果发现DNA损伤进一步加剧，但是F96对肿瘤细胞的杀伤作用却得到显著逆转。PARP抑制剂的作用能够被回补β-烟酰胺单核苷酸(Nicotinamidemononucleotide，NMN)完全逆转。上述结果提示，F96的抗肿瘤优势主要通过同时诱导DNA损伤和抑制NAMPT酶活，同时抑制NAD+生成、促进消耗，从而造成细胞内NAD+耗竭，抑制肿瘤细胞生长。<br>　　此外，本论文合作开展了STAT3抑制剂的研究，发现了新型STAT3抑制剂B18和B19，并初步探索了其抗肿瘤作用，为STAT3抑制剂的研发奠定了基础。<br>　　综上所述，本研究主要围绕NAD+补救合成途径的关键代谢酶NAMPT，一方面针对eNAMPT的免疫调节功能发现了新的NAMPT-PROTAC分子A7，能够显著降低肿瘤分泌型NAMPT水平，阻断其对MDSC的促扩增作用，提高免疫应答;另一方面采用双靶策略得到NAMPT酶活抑制剂与苯丁酸氮芥融合的F96，通过同时诱导DNA损伤与抑制NAMPT的酶活功能，显著增强肿瘤细胞NAD+耗竭，显示出抗肿瘤优势。本研究的发现为深入认识NAMPT在肿瘤中的功能提供了新的信息，为靶向NAMPT抑制剂的研发提供了新的思路。