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摘要蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase，PTK)是参与调节细胞增殖和死亡相关信号转导的关键激酶。根据其结构，可以分为受体酪氨酸激酶(receptorPTK，RTK)和非受体酪氨酸激酶(non-receptorPTK，NRTK)两类。RTK主要包括血小板源性生长因子受体(platelet-derivedgrowthfactorreceptor,PDGFR)、表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR）、成纤维生长因子受体（fibroblastgrowthfactorreceptor,FGFR）、原肌球蛋白受体激酶(tropomyosinreceptorkinase，TRK)等;NRTK是传递胞内信号的胞质蛋白，可以与细胞膜结合或具有核特异性，主要包括脾酪氨酸激酶(spleentyrosinekinase，Syk)、在肝癌中表达的酪氨酸激酶(tyrosinekinaseexpressedinhepatocellularcarcinoma，TEC)和粘附斑激酶(focaladhesionkinase，FAK)等激酶家族。<br>　　PTK的异常表达通常导致肿瘤的发生、发展，因此，PTK已经成为抗肿瘤治疗的重要靶点。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors，TKIs)与PTK的ATP结合位点竞争性结合，已在肿瘤治疗方面取得了很大进展，但获得性耐药的产生限制了其疗效。本论文主要开展了针对突变型TRK的第二代TRK小分子抑制剂ASD-098的抗肿瘤活性及机制研究。同时针对BTK抑制剂耐药的细胞，重点探索了其产生获得性耐药的分子机制和应对策略。<br>　　TRK家族是典型的受体酪氨酸激酶，包括TRKA、TRKB和TRKC三个成员，分别由NTRK1、NTRK2、NTRK3基因编码。正常生理条件下，TRK充当神经营养蛋白的高亲和力受体，在神经元的生长和发育中起重要作用，但NTRK突变或重排而导致TRK异常激活是恶性肿瘤的驱动力之一。第二代TRK小分子抑制剂是对突变型NTRK亚型具有更高活性的新一代抑制剂，能够有效克服由激酶结构域突变介导的获得性耐药。目前国际上主要有LOXO-195和TPX-0005两个第二代TRK抑制剂成功上市，且仅有LOXO-195选择性抑制TRK活性。因此，为了研发具有我国自主知识产权的第二代选择性TRK抑制剂，我们评价了新型小分子TRK抑制剂ASD-098的药理学活性。激酶测试结果显示ASD-098是一个高效的TRK抑制剂，显著抑制非突变型及耐药突变型TRK活性;对耐药突变激酶的抑制活性比LOXO-195强1～4倍，比第一代抑制剂LOXO-101至少强10～40倍，并且其代谢产物ASD-097对TRK同样有明显抑制活性。细胞增殖抑制实验表明ASD-098选择性地抑制非突变型和突变型TRK融合蛋白阳性细胞的增殖，在高表达非突变型TRKA/B/C融合蛋白的Ba/F3细胞中，ASD-098抑制细胞增殖的IC50＜0.3nM，强于LOXO-101和Etrectinib;更重要的是，ASD-098同样显著抑制高表达突变型TRK融合蛋白阳性细胞增殖，如表达TPM3-TRKAG595R、LMNA-TRKAG667C和ETV6-TRKCG623R的Ba/F3细胞，活性比LOXO-195强3～4倍。此外，ASD-098抑制TRK及其介导的下游ERK1/2磷酸化、诱导细胞G0/G1期阻滞和细胞凋亡。体内抗肿瘤药效实验发现ASD-098通过抑制TRK-ERK1/2信号通路而显著抑制裸小鼠皮下移植瘤生长，对非突变型TRK融合蛋白阳性肿瘤如AFAP1-TRKBWT及突变型TRK融合蛋白阳性肿瘤如TPM3-TRKAG595R、ETV6-TRKCG623R均有显著疗效，而没有明显毒性;ASD-098同时具有良好的药代动力学特性，在肿瘤组织中，比LOXO-195有更高暴露水平和吸收速率，且消除更慢。以上结果说明ASD-098是一个高效的第二代TRK抑制剂，可用于克服临床上突变型NTRK融合基因产生的耐药。<br>　　布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton''styrosinekinase，BTK)属于非受体酪氨酸激酶TEC家族，是BCR信号通路中的关键成分，对许多B细胞来源恶性肿瘤细胞增殖和存活至关重要，因此，BTK是一个重要的抗肿瘤靶点。BTK抑制剂伊鲁替尼(ibrutinib)是一种ATP竞争性抑制剂，与BTK的ATP结合位点的Cys481共价结合，已经上市，用于治疗慢性淋巴细胞白血病(chroniclymphocyticleukemia，CLL)、套细胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma，MCL)和华氏巨球蛋白血症(Waldenstromsmacroglobulinemia，WM)等，但几乎有三分之一的患者对ibrutinib存在原发性固有耐药，而其他患者应用ibrutinib后出现获得性耐药。因此，研究ibrutinib耐药机制并寻找有效策略克服ibrutinib耐药十分重要。<br>　　弥漫性大B细胞淋巴瘤DOHH-2经过ibrutinib长期处理产生了对ibrutinib耐药，该耐药细胞株命名为DOHH2/Ibru-2。在DOHH2/Ibru-2细胞中，没有发现BTK缺失和突变，但mTOR和AKT高激活;进一步研究发现PI3K/mTOR抑制剂BKM120选择性抑制DOHH2/Ibru-2细胞中AKT和mTOR磷酸化，并且联用BKM120和ibrutinib能够克服mTOR和AKT高激活引起的耐药。另外，在稳定表达BTKC481S对ibrutinib耐药的32D细胞中也证实联用BTK抑制剂和PI3K/mTOR抑制剂可以克服点突变引起的获得性耐药。<br>　　综上所述，ASD-098是一个新型高效的第二代TRK小分子抑制剂，在克服NTRK突变引起的获得性耐药治疗中具有广阔前景;另外，对于BTK抑制剂耐药患者，联合抑制BTK和PI3K/mTOR信号通路可能是克服ibrutinib耐药的有效策略。