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摘要基因的正确表达受到精细的网络调控，这是一切生命活动的基础。基因敲除和转录增强是研究基因功能及调控机制中最被广泛使用的手段。CRISPR-Cas9技术的产生，为基因编辑及表观遗传修饰带来了革命性的技术突破，极大推动生命科学的发展。然而，现有条件下由于无法将基因编辑元件很好地导入早期胚胎，也就难以实现在胚胎发育时期对基因转录的时空操纵。孤雄单倍体囊胚来源的类精子干细胞(Spermatid-likeStemCells，SLSCs)能够持续培养并稳定维持单倍性，其可作为精子替代物注射到卵子中产生健康的半克隆小鼠（称为半克隆技术），是传递基因编辑元件到胚胎中的理想载体。<br>　　在本研究中，我们结合SLSCs与CRISPR-Cas9技术，构建了条件性转录激活LSL-IGA(loxP-STOP-loxPcontrolledinsituGeneActivation)和条件性基因敲除LSL-Cas9（loxP-STOP-loxPcontrolledCas9）小鼠模型，以及携带有sgRNA和Blimpl-Cre元件的类精子干细胞系。随后以半克隆技术将两者合二为一，获得携带全部调控元件的重构胚。依赖于Blimp1-Cre的组织特异性表达，该重构胚胎能够在小鼠原始生殖细胞（PrimordialGermCells，PGCs）中成功实现对基因的原位转录激活或基因敲除（称为“两步法”）。利用该技术，我们发现在PGCs中特异性转录激活Procr或Otx2均不影响PGC发育;而胚胎致死基因Trim28及Rbm14的条件性敲除则会导致PGC发育的完全失败。随后，我们将两条sgRNA成对串联构建组成Paired-sgRNA以提高敲除效率，发现该条件下能够特异在PGCs中实现对DNA序列的大片段删除，提示Paired-sgRNA介导的条件性基因删除可用于LncRNA或其他调控元件在PGCs中的功能研究。<br>　　为进一步优化条件性基因敲除系统，我们将Blimp1-Cre与LSL-Cas9元件同时组合在单一类精子干细胞上，并将其注入到野生型卵子中，以此能够在不依赖LSL-Cas9小鼠提供卵子的情况下，一步实现PGCs的条件性基因敲除（称为“一步法”）。针对该系统中Blimp1-Cre在细胞水平会发生一定程度泄漏并引起Cas9提前激活进而敲除靶基因这一现象，我们尝试使用流式细胞分选技术(Fluorescence-activatedCellSorting，FACS)将泄漏后表达RFP荧光的细胞去除，即可有效减少泄漏胚胎的出现。<br>　　基于这套Cre依赖的CRISPR-Cas9条件性基因敲除系统(Cre-dependentCRISPR-Cas9ConditionalKnock-OutSystem，4C-KO)，我们针对30个早期胚胎致死的表观遗传基因在PGC发育过程中的作用展开在体条件性基因筛选研究。为此，我们构建了一个包含90条sgRNA的病毒文库用于感染细胞，随后注入卵子形成胚胎。分析所获得的138只携带单条sgRNA的半克隆胚胎后，我们发现其中12个基因的敲除会导致PGC发育失败。对其中Brd4、Crebbp、Cxxc1、Hcfc1、Men1和Sin3a6个基因的敲除验证实验，确认了其对PGC发育的确至关重要。<br>　　综上，我们结合类精子干细胞技术和CRISPR-Cas9技术成功实现了对小鼠PGCs的在体条件性基因激活及遗传筛选，展现了该方法应用于在体研究基因功能的强大潜力。而更重要的是，通过更换不同组织特异表达基因驱动的Cre，4C-KO系统亦有望实现在其它组织中的高通量基因筛选。