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摘要蛋白质是生物体内执行生命活动的基本单元，通过与其他分子的结合和解离参与细胞生命活动的每一项进程。蛋白质能与多种配体分子通过非共价相互作用力结合形成复合物，这种可逆的相互作用被称为配体-蛋白相互作用。能与蛋白质结合形成复合物的配体分子可以是内源性的，包括核酸、蛋白质等生物大分子和代谢物小分子，亦可是外源性的药物小分子等等。翻译后修饰也会影响蛋白质对配体的特异性识别，从而调节配体-蛋白相互作用的形成和下游细胞信号的转导。针对这些配体-蛋白相互作用的研究促进了新药开发、生物标志物发现，有助于我们更深入地理解疾病相关分子机制、细胞信号转导等与人类健康息息相关的生物学问题。近年来，基于质谱的蛋白质组学技术飞速发展，推动了配体-蛋白相互作用研究的发展。本论文针对该领域研究目前存在的问题，在药物小分子-蛋白质、蛋白质-蛋白质这两个层次，发展了三种基于蛋白质组学的配体-蛋白相互作用研究新方法。<br>　　多数情况下，药物分子通过与其直接靶蛋白发生特异性结合，调节靶蛋白的结构性质、影响直接结合蛋白和下游蛋白的生物功能，从而起到治疗效果。目前药靶筛选领域常用的热蛋白质组分析方法通过测定药物结合靶蛋白的热稳定性变化来进行药物靶蛋白筛选。针对热蛋白质组分析方法所需要的细胞样品起始量大、不适合大规模样品批量处理等问题，本论文发展了一种微球辅助的热致沉淀蛋白质组方法(MAPS)，通过检测加药/空白处理下微球捕获的沉淀样品之间的蛋白定量差异，即可推断与药物发生直接相互作用的靶蛋白。因为在样品前处理阶段引入了微球材料，MAPS方法操作简便、可拓展性好，包括加热、烷基化、酶解等样品前处理过程都可在微球表面上操作，这一流线式的MAPS工作流程使得快速高通量的药靶筛选成为可能。在低至20μg起始蛋白量的微量样品分析中，我们将该方法应用到多种临床药物和模型药物（包括甲氨蝶呤，雷替曲塞，环孢菌素A，SHP099）的靶蛋白研究，使用二甲基标记定量，从2000多个背景蛋白中成功地筛选到了这些药物的已知靶蛋白，且靶蛋白都发生了显著性变化。在格尔德霉素模型中，成功地筛选到了已知的靶蛋白HSP90家族，并发现了潜在的脱靶蛋白PRDX家族。在泛激酶抑制剂星孢菌素模型中，从超过6000个蛋白的定量结果中，筛选到了40个有潜力的候选靶蛋白，其中有32个蛋白为已知的蛋白激酶。<br>　　在小分子药物-蛋白质相互作用层次，本论文还发展了一种基于机械力诱导蛋白沉淀的配体-蛋白相互作用研究方法，并将其应用于药物靶蛋白筛选。这种方法是基于一种全新的原理所设计的，利用机械力诱导蛋白沉淀这一特性，向样品溶液中添加微球材料以提供涡旋、产生机械力，诱导样品中的蛋白变性沉淀并聚集到微球表面。同热致沉淀方法类似，与药物小分子配体结合后，靶蛋白的稳定性比游离状态的稳定性高、更不易被机械力诱导沉淀，通过检测药物/空白处理之间机械力诱导的沉淀蛋白质组的定量差异，即可识别出被药物稳定化的靶蛋白。这种基于机械力的方法能实现高灵敏度、高特异性的药物靶蛋白筛选，我们将其成功地应用到多种临床和模型药物的靶蛋白、脱靶蛋白研究，使用二甲基标记定量方法，从约2000个背景蛋白中成功地筛选到了显著性变化的已知靶蛋白。在研究不同细胞系中星孢菌素的靶蛋白时，我们使用该方法结合DIA定量技术，分别从K562和Hela细胞系的4159和3837个背景蛋白中筛选到了42和38个潜在靶蛋白。该方法的原理与现有的其他药物靶蛋白筛选方法都不相同，因此它能够为药物靶点发现提供一个全新的视角。在雷替曲塞的靶蛋白研究中，我们所发展的基于机械力诱导沉淀的方法是首个检测到二氢叶酸还原酶(DHFR)也是雷替曲塞的直接靶蛋白的非化学修饰药靶筛选方法。<br>　　蛋白质很少单独参与细胞生命活动，通常与其他蛋白质相互作用形成复合物来共同执行生物学功能，在酶催化、代谢通路、免疫调节、信号转导等几乎所有的细胞生命进程中扮演着关键的角色。而蛋白质翻译后修饰在蛋白质复合物的组装与解聚过程中发挥着重要的调控作用，尤其是广泛存在的磷酸化修饰已被揭示参与着众多细胞信号通路，并调节相关的蛋白质复合物。在蛋白质-蛋白质相互作用层次，针对现在蛋白质复合物中磷酸化修饰位点鉴定困难的问题，本论文发展了一种拟靶向质谱采集策略，用于高灵敏度地分析复合物样品中低丰度的磷酸化修饰肽段。该方法无需富集、反相分级等样品前处理步骤，在质谱分析过程中可以在线地隔离、富集、分析磷酸化肽段。我们将该方法应用到EGF刺激相关的Shc1蛋白质复合物的时空动态研究中，从亲和纯化得到的超微量Shc1复合物样品中，鉴定到了34个Shc1蛋白质复合物组成成员蛋白和82个非冗余的磷酸化修饰位点。基于EGF刺激四个时间点的Shc1复合物的定性定量分析表明，Shc1复合物组成蛋白及其上磷酸化修饰都随EGF刺激时间延长而不断变化，这一结果为以磷酸化为代表的翻译后修饰调控蛋白质相互作用理论提供了重要的数据支撑。