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摘要随着纳米技术的快速发展，纳米材料已在日常生活用品和工业领域得到了广泛的应用，同时其生物安全性也引起了公众的关注。四膜虫是在淡水环境中广泛存在的单细胞真核原生动物，处于水生食物链底端，是纳米材料进入水生食物链的潜在“入口”。四膜虫在实验室中易保存和培养，又对环境变化较敏感，是优良的水生毒理学模式生物。研究纳米材料对四膜虫的生物效应，对理解纳米材料的水生态毒理学效应和纳米材料在水环境中的迁移转化具有重要意义。<br>　　四膜虫既能无性繁殖也能有性繁殖，有性繁殖对四膜虫种群的遗传信息更新和适应恶劣环境有重要意义。本论文根据四膜虫的繁殖特征，分别研究了典型纳米材料对四膜虫无性和有性繁殖的影响以及环境相关剂量下纳米材料在四膜虫细胞中的单细胞累积特征和毒性效应。<br>　　基于流式细胞术建立了四膜虫细胞密度和有性繁殖率的高通量检测方法，对细胞密度≤106cells/mL的样品，该方法对一个样品的检测时间小于1min，解决了传统血球计数板计数耗时长的问题，为评估纳米材料对四膜虫的毒性效应提供高效的分析手段。为解决纳米材料生物效应研究中存在的暴露剂量过高和细胞异质性问题，基于质谱流式细胞技术建立了环境剂量下单细胞水平的四膜虫细胞中超痕量金属纳米材料的定量和生物效应分析方法，对于单个四膜虫细胞，该方法的金元素的检测限低至6.67×10-18g。<br>　　基于以上方法，对贵金属、金属氧化物、二维纳米材料等典型纳米材料对四膜虫的毒性进行了研究。结果表明，在以10μg/mL剂量暴露24h后，黑磷纳米片(BP)对四膜虫表现出了最强的毒性。为了研究纳米材料对四膜虫有性繁殖的影响，在对四膜虫细胞密度无影响的剂量下，对四膜虫进行了TiO2和CeO2纳米颗粒的暴露，但结果表明TiO2和CeO2纳米颗粒对四膜虫有性繁殖没有明显影响。<br>　　由于BP对四膜虫无性繁殖表现出了较强的抑制效应，进一步研究了BP在四膜虫细胞中的累积和毒性机制。通过3D拉曼成像等技术手段，发现了BP可以通过四膜虫的口器进入四膜虫细胞，并在四膜虫的酸性囊泡中累积，造成四膜虫形态畸形、细胞膜碎裂和纤毛大量脱落。BP在环境中易降解，因此还探讨了BP降解产物对其毒性的贡献。结果表明，BP对四膜虫表现出的毒性效应是由BP的降解产物和四膜虫细胞内累积的固体BP共同造成。BP暴露诱导四膜虫细胞内活性氧含量显著上升引起的氧化应激，是黑磷纳米片对四膜虫产生毒性的机制之一。<br>　　利用基于质谱流式细胞术建立的四膜虫单细胞分析方法，研究了环境剂量下纳米金颗粒(AuNPs)在四膜虫细胞中的单细胞累积特征和毒性效应。通过对四膜虫进行持续96小时1ng/mL的AuNPs暴露或外排实验，发现四膜虫可以快速累积和排出AuNPs，且四膜虫个体异质性较强，它们吸收的AuNPs颗粒数差异可达103个。利用顺-二氯二氨合铂(cisPt)只能进入细胞膜通透细胞的特点，对暴露后的四膜虫进行cisPt标记，监测了暴露过程中四膜虫的膜完整性，发现1ng/mL的AuNPs暴露对四膜虫的细胞膜没有影响。进一步探讨了极低暴露剂量下(0.001ng/mL)四膜虫对不同粒径AuNPs的累积特征，发现四膜虫有吞噬更小AuNPs的趋势。在0.001ng/mL的暴露浓度下，仍然有极少数的四膜虫可以吞噬数百个5nm的AuNPs。这些吞噬能力较强的“稀有群体”可能是后续研究中更值得关注的对象。<br>　　综上，本论文利用流式细胞术和质谱流式细胞术建立了四膜虫的生物效应检测方法;然后，以四膜虫细胞密度和有性繁殖率为毒性评估指标对典型纳米材料进行了毒性筛查，并对其中毒性较强的黑磷纳米片进行了进一步的毒性机制研究;最后，探讨了环境剂量下金属纳米材料在四膜虫细胞中的单细胞累积特征和毒性效应。研究结果可为纳米材料的水生态风险评估提供数据支撑，同时也为纳米材料的水生态毒理研究提供了新的研究技术和思路。