检索历史 清除

摘要RNA编辑是一种重要的转录后修饰事件，它广泛存在于后生动物及植物中，影响基因的表达和调控。目前发现最普遍的RNA编辑形式是由ADAR蛋白家族介导的A-to-IRNA编辑。ADAR蛋白作用于RNA的双链区域，催化腺嘌呤碱基脱氨生成次黄嘌呤碱基。这种A-to-I的转换可能会造成RNA剪切方式或蛋白序列翻译的改变，对正常的生命活动具有重要影响。本论文对A-to-IRNA编辑事件的识别和操控两个方面进行了研究。<br>　　(1)基于OxfordNanopore测序技术识别A-to-IRNA编辑位点的神经网络模型<br>　　OxfordNanoporeDirectRNA测序技术是近几年的新兴技术，它不经PCR扩增直接对细胞内RNA分子进行测序，为直接检查RNA修饰，包括RNA编辑提供了技术基础。但如何识别RNA修饰包括RNA编辑的信号仍是世界级的难题。基于NanoporeDirectRNA测序技术，我们开发了一款可以鉴定RNA编辑位点的软件—DeepEdit。DeepEdit的核心是一个全连接神经网络模型，以Nanopore测序产生的原始电信号值作为输入，对单条RNA分子上的编辑位点进行预测。我们使用自己测序产生的酵母全转录组RNA编辑数据对模型进行训练和测试。DeepEdit可以很好地识别酵母RNA分子上的编辑位点，AUC值达到0.9608。在跨物种测试中，DeepEdit识别人和绿猴转录组中的编辑位点时也有很好的表现，AUC值分别达到了0.9122和0.8595。借助于Nanopore测序读长较长的优势，DeepEdit还可以用于评估编辑位点在空间上是否存在关联，如phasing和编辑位点之间的互斥现象。此外，我们还开发了另一个神经网络模型—IGmodel，用于在没有个体基因组重测序数据的情况下鉴定编辑位点，以排除基因组DNA上A-GSNP事件对编辑位点鉴定的干扰。DeepEdit-IGmodel的AUC值达到0.9889。<br>　　(2)植物细胞内A-to-IRNA精确编辑系统的构建及对植物RNA病毒的编辑<br>　　与基因组DNA编辑不同，RNA定点编辑可以在不改变编码基因的情况下对基因的表达或功能进行调控，具备更好的可逆性以及时间空间可控性，可以作为DNA遗传操作技术的补充。为了实现对植物RNA的定点操控，我们开发了植物细胞内表达的RNA定点编辑系统。该系统选用CRISPR系统中来自Prevotellasp.P5-125菌株的Cas13b蛋白(PspCas13b)。突变后的dPspCas13b具有RNA靶向活性，但不会造成RNA的降解。我们将dPspCas13b与具有脱氨酶活性的人源adenosinedeaminaseactingonRNAtype2(hADAR2d)蛋白催化结构域融合，设计了一种植物细胞表达的A-to-IRNA定点编辑系统。研究发现该系统可以在本氏烟草（Nicotianabenthamiana）叶片细胞内实现对烟草花叶病毒（tobaccomosaicvirus，TMV）突变体的编辑回复。但是我们使用该系统对本氏烟草内源RNA进行编辑时，并未检测到编辑活性。