近红外荧光成像引导下超声定点释药可视化靶向治疗类风湿关节炎的研究-论文-万方医学网

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近红外荧光成像引导下超声定点释药可视化靶向治疗类风湿关节炎的研究

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摘要本文主要从以下几方面进行论述： 　　第一章靶向声学脂质体的制备与表征 　　目的： 　　本章通过探索iELPs的最佳制备条件，拟成功构建iELPs，并对其进行理化性质和生物学性质表征，通过体内、体外实验对iELPs的靶向性进行研究，为iELPs的稳定制备提供技术支持，为其进一步应用于RA治疗及疗效监测奠定基础。 　　方法： 　　(1)本研究通过既定磷脂配比，使用薄膜水化法制作iRGD多肽介导的载ICG和MTX的靶向声学脂质体前体，利用真空冷冻干燥技术使声学脂质体前体磷脂双分子层内形成稳定存在的空气核，得到靶向声学脂质体(iELPs)，使用类似方法得到非靶向声学脂质体(the Echogenic liposomes containing MTX and ICG decorated without iRGD peptide，ELPs)。本研究对靶向声学脂质体的形态、粒径、分布、包封率及稳定性进行表征并测定。 　　(2)使用免疫印迹试验量化人脐静脉内皮细胞株(Human umbilical vein endothelial cell line，HUVECs)、类风湿关节炎滑膜成纤维细胞株(MH7A)、小鼠原代巨噬细胞株(RAW264.7cells)中αvβ3受体膜蛋白的表达定量。利用HUVECs细胞株、RAW264.7细胞株、MH7A细胞株对iELPs的靶向能力及特异性性进行定性及定量的评价。 　　结果： 　　(1)成功制备的iELPs粒径为(113.35±4.61)nm，多分散指数(Polydispersity index，PDI)为0.22±0.01，电位(-12.27±3.37)mv，为负电荷，MTX包封率为(68.72％±0.64％)，ICG包封率为(99.14％±0.82％)，冻干状况下可保持粒径稳定状态达五周以上，12小时MTX血清药物渗漏率低于30％，具有一定血清稳定性。 　　(2)体外实验结果表明，αvβ3受体膜蛋白在HUVECs细胞株中表达水平最高，MH7A细胞株次之，RAW264.7细胞株最低。不同脂质体药物组与HUVECs细胞株分别孵育后，iELPs组较ELPs组细胞质间的红色荧光信号强度明显提升;使用iELPs与三种不同细胞株共孵育后，HUVECs细胞株的胞质红色荧光信号强度最高。 　　结论： 　　(1)成功合成了形貌规则、粒径均一的iELPs，其粒径稳定在100nm左右，携带轻微负电荷，分散性好，包封率高; 　　(2)iELPs在粒径结构、血液循环、荧光保护三个方面具有良好的稳定性; 　　(3)iELPs在体外对HUVECs细胞系具备良好的靶向性，且制备的冻干过程对iELPs的靶向性未产生影响; 　　(4)iELPs在体内具有良好的RA炎症关节靶向选择能力及特异性，并且可以优化药物的体内分布; 　　(5)iELPs可进行NIRF成像，具备实现生物医学成像的实时示踪并且引导疾病治疗的初步基础。 　　第二章靶向声学脂质体的可视化定点控释 　　目的： 　　本章通过CIA模型的近红外荧光成像实验，评估iELPs在体实时示踪能力，并筛选生物医学成像引导可视化治疗的参数条件，对iELPs的超声控释药物能力进行测试，通过筛选合适的体外细胞学实验超声参数，为iELPs在体内的NIRF成像可视化引导药物定点控释提供新方法。 　　方法： 　　(1)根据药物选择将胶原蛋白诱导关节炎(CIA)模型小鼠分为以下3组（6只/每组）;iELPs药物组、ELPs药物组、Free ICG药物组。于尾静脉注射药物后30min，1h，2h，3h，6h，9h，12h，15h，24h分别将各组小鼠行NIRF成像并对荧光强度半定量分析，找出峰值时间，并评估荧光示踪能力。根据上述实验得出的iELPs荧光强度峰值时间，于超声处理前、超声处理后、超声处理后3h将CIA小鼠行NIRF成像并进行荧光强度半定量分析，并评估NIRF成像引导下体内控释iELPs的能力。 　　(2)利用声阻抗特性对iELPs的声学稳定能力进行评估，使用Vevo2100超高分辨率小动物超声影像系统的高频超声探头(MS-250，24MHz)，于0min、15min、30min、1h、2h、3h、4h采集图像并进行数据分析，评估其声学稳定性。于超声处理前、后对iELPs进行超声成像并对超声回声信号强度进行定量分析，评估其声学响应能力。使用不同超声声压及时间对iELPs进行辐照处理，评估不同超声参数下iELPs药物控释的能力。 　　结果： 　　(1)小鼠体内药物实时示踪实验结果表明，利用近红外荧光(Near-infrared fluorescence，NIRF)成像对后爪关节炎症部位进行成像，iELPs组CIA模型小鼠踝关节处荧光信号于6h达到峰值，此时iELPs组荧光信号是ELPs组的2.72倍，是Free ICG组的7.87倍。使用聚焦超声控释小鼠四爪部位药物，超声组荧光强度相较非超声组提升了2.55倍。 　　(2)室温静置4h后，iELPs超声图像显示为细密、点状、均一的高回声，仍具备超声成像能力，表明其具备良好的声学稳定性。使用条件为1.0MHz、0.35Mpa、1min的低频超声辐照iELPs后，图像由密集、均一的点状高回声变为稀疏、散在分布的粗大点状高回声，同时MTX药物释放率达（引.23％±4.06％），并且MTX释放率随低频超声声压增加、辐照时间延长而递增，表明iELPs对超声具备良好的声学响应性。 　　结论： 　　(1)成功实现了iELPs的体内NIRF实时示踪及病灶区域浓聚程度实时监测，并通过图像分析测到iELPs经尾静脉注射6h后，CIA模型小鼠炎症关节部位药物浓聚达高峰，并以此时间点作为超声辐照的时机，引导后续控释治疗; 　　(2)通过NIRF成像成功观测到了CIA模型小鼠体内低频超声引发的药物释放，提高了iELPs的体内释药效率; 　　(3)iELPs内部空气核的存在，使其声阻抗与周围组织产生差异，具有良好的超声显影效果，并能保持显影能力，稳定维持达4h以上; 　　(4)iELPs内部空气核具有优秀的低频超声响应能力，经超声辐照后，能够破坏脂质体结构游离至脂质体外，并显著减低超声回波信号; 　　(5)低频超声能够使iELPs内部空气核发生响应，将脂质体结构破坏并使MTX释放至外部; 　　(6)1MHz频率，0.20MPa声压，90s超声辐照时间是合适的体外治疗实验低频超声作用参数，此参数下MH7A细胞活性不会受到显著影响; 　　(7)从iELPs中释放出来的MTX能够被MH7A细胞有效摄取，并抑制MH7A细胞的活性。 　　第三章靶向声学脂质体类风湿关节炎在体治疗的效果评价 　　目的： 　　本章拟建立CIA小鼠模型，对RA的在体治疗超声参数进行安全性评估及筛选，对iELPs联合低频超声在体治疗RA的疗效及生物安全性进行评估，为RA的可视化可控释治疗提供新的研究方向。 　　方法： 　　使用不同声压、时长的低频聚焦超声（1MHz频率，连续波，正弦波）分别辐照小鼠后爪部位或离体肌肉组织，实时监测小鼠皮温变化，辐照后形貌评估小鼠后肢及离体肌肉组织的大体外观，评估超声的热损伤及机械损伤的情况，并筛选在体治疗实验的超声参数。 　　结果： 　　0.35MPa(1min、3min、5min)和0.30MPa(3min，5min)的超声参数条件下，肌肉组织受到明显的热损伤，外观变白;辐照时间≥3min，辐照声压≥0.30MPa时，皮温超过45℃，为热休克蛋白失活温度，同时小鼠腿部红肿不可逆，进而诱发关节区严重肿胀、破溃，远期甚至表现为坏疽，断肢。将未对组织产生明显损伤，且功率相对最大的参数（0.20MPa辐照声压、3min辐照时间）选为最佳体内低频超声辐照参数。 　　结论： 　　(1)优化出较理想的体内治疗低频聚焦超声参数:1MHz频率、0.20MPa声压、连续波、正弦波、超声辐照时间3min，此参数下的低频聚焦超声对组织未造成明显的热损伤; 　　(2)iELPs联合低频超声治疗能够有效抑制RA的进展，缓解RA的症状; 　　(3)iELPs联合低频超声治疗具有良好的体内生物安全性，不会对小鼠的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺部、肾脏）组织病理学的细胞形态及排列造成明显损害，小鼠行为活动未发生异常。 　　全文总结： 　　本研究成功构建了iRGD多肽介导的载MTX及ICG靶向声学脂质体(iELPs)，发挥靶向穿膜肽iRGD的药物靶向递送及加速细胞穿透作用，并利用NIRF成像技术高度图像灵敏度结合ICG的荧光示踪能力，以低频低强度超声定点控释MTX，将超声药物控释治疗与磷脂类纳米医学有机结合，实现了RA炎症关节的靶向可视化可控释治疗。体内、外实验结果表明，载MTX靶向声学脂质体控释体系可有效选择性杀伤体外MH7A细胞，降低CIA动物模型的AI评分并改善受累关节的影像学表现，是提升RA治疗效果并降低MTX内脏毒副作用的有效策略之一，为未来RA的早期诊断和有效靶向治疗奠定了一定的基础。