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摘要研究背景:<br>　　胃癌是我国以及全球最常见的恶性肿瘤之一，其每年新发和死亡病例位于所有肿瘤前列。目前为止仍然有很多胃癌患者在初治时就是癌症晚期以及具有很低的5年生存率。胃癌发生发展的机制仍未完全阐明，并且可用于诊断治疗的靶点很有限。为此，进一步阐明胃癌发生发展的机制以及找到更有效的生物标志物和治疗靶点是非常迫切的。<br>　　卷曲螺旋蛋白65(coiled-coildomaincontaining65，CCDC65)属于卷曲螺旋蛋白家族。卷曲螺旋蛋白家族基因与多种疾病相关，其中包括癌症、代谢性疾病、听力损失、表观遗传疾病、线粒体疾病和心脏病等等。然而，关于CCDC65在癌症中的作用和机制的研究鲜有报道。<br>　　研究内容和方法:<br>　　1.探究CCDC65在胃癌组织中的表达及其与临床参数和预后的相关性<br>　　(1)免疫组化实验观察CCDC65在胃癌组织芯片中的表达;<br>　　(2)探究CCDC65对胃癌患者预后的影响;<br>　　(3)探究CCDC65对胃癌患者临床参数的影响。<br>　　2.探究CCDC65在胃癌中的功能作用及具体分子机制<br>　　(1)用慢病毒，质粒和siRNA构建瞬时和稳定转染的CCDC65胃癌细胞:荧光定量PCR和Westernblot实验鉴定转染效率;<br>　　(2)MTT，EdU，Transwell，Boyden和划痕等细胞功能实验和裸鼠皮下荷瘤模型，肺转移模型等动物实验观察CCDC65对胃癌细胞增殖，侵袭转移的影响;<br>　　(3)利用Westernblot检测CCDC65对p-AKT1(Ser473)，N-cadherin，E-cadherin，Vimentin，CCND1以及P21蛋白表达的影响。<br>　　3.鉴定CCDC65相互作用蛋白<br>　　(1)质谱分析和蛋白免疫共沉淀筛选可能与CCDC65相互作用的蛋白;<br>　　(2)Co-IP结合Westernblot验证CCDC65与ENO1相互作用;<br>　　(3)细胞免疫荧光观察CCDC65与ENO1的共定位;<br>　　(4)Co-IP检测CCDC65截短片段与ENO1截短片段的结合情况。<br>　　4.探究CCDC65对相互作用蛋白ENO1的表达调控关系<br>　　(1)荧光定量PCR和Westernblot探究CCDC65对ENO1表达的调控关系;<br>　　(2)探索CCDC65对ENO1调控的具体机制。<br>　　5.探究CCDC65对ENO1与AKT1相互作用的影响<br>　　(1)数据库和文献检索ENO1与AKT1相互作用;<br>　　(2)Co-IP结合Westernblot验证ENO1和AKT1的相互作用;<br>　　(3)细胞免疫荧光观察ENO1和AKT1的共定位;<br>　　(4)Co-IP检测ENO1和AKT1截短片段的具体结合情况;<br>　　(5)CCDC65对ENO1与AKT1相互作用的影响。<br>　　6.探究二甲双胍对CCDC65表达的影响<br>　　(1)荧光定量PCR和Westernblot探究二甲双胍对CCDC65表达的调控;<br>　　(2)探究二甲双胍对CCDC65以及ENO1-AKT1复合物及下游分子的影响。<br>　　研究结果:<br>　　1.在胃癌组织中CCDC65呈低表达，且低表达CCDC65的胃癌患者预后较差;<br>　　2.CCDC65通过抑制AKT1磷酸化来抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭;<br>　　3.CCDC65与ENO1存在相互作用;<br>　　4.CCDC65通过招募E3泛素连接酶FBXW7促进ENO1的泛素化;<br>　　5.CCDC65抑制ENO1与AKT1的相互作用;<br>　　6.二甲双胍增强CCDC65在胃癌中的抑癌作用。<br>　　研究结论:<br>　　二甲双胍诱导的CCDC65通过招募FBXW7促进ENO1的泛素化降解及抑制AKT1的激活进而抑制胃癌的增殖转移。