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摘要目的:<br>　　Hedgehog(Hh)信号通路的异常活化在多种恶性肿瘤的发生及发展中起关键作用，尤其是髓母细胞瘤(Medulloblastoma，MB)。MB是最常见的儿童恶性脑肿瘤之一，其中，Shh亚型MB占所有病例的约30％。目前，MB的治疗仍以手术、全脑全脊髓放疗以及化疗为主。然而，治疗伴随的认知障碍等长期严重不良反应使得人们将目光转移到分子靶向治疗。Smoothened(SMO)是Hh通路上游的关键调控元件，因此SMO已成为Hh通路驱动的MB的新治疗靶点。目前，已有多种SMO抑制剂进入MB临床试验，并在治疗初期取得了良好疗效。然而，由于SMO或下游元件基因突变导致耐药性的出现及肿瘤复发，极大地限制了SMO抑制剂的临床应用。因此，研发新型、可有效逆转耐药的Hh通路抑制剂显得尤为迫切。土荆皮乙酸(PseudolaricacidB，PAB)是一种广谱抗肿瘤天然小分子化合物，然而目前关于PAB作用于Hh信号通路或用于治疗MB的相关研究未见报道。因此，本课题旨在探索PAB在体外及体内通过作用Hh信号通路抑制她生长的抗肿瘤活性及其潜在分子机制。<br>　　方法:<br>　　在体外实验中，首先，我们通过MTT法从26个天然抗肿瘤小分子化合物中筛选出对人髓母细胞瘤细胞(DAOY)活性抑制效果最强的药物——PAB;接着，我们选用DAOY细胞、人肺腺癌细胞系(A549、H1299)、人胃腺癌细胞系(BGC-823、SGC-7901、AGS)、人乳腺癌细胞系（MDA-MB-231）、人宫颈癌细胞系(Hela)以及人肝癌细胞系（SMMC-7721、MHCC-97H）共十个肿瘤细胞系，westernblotting法检测细胞Gli1蛋白表达，给予指定浓度PAB处理后，MTT法检测细胞活力。然后，我们将DAOY细胞、原代颗粒神经元前体细胞(GranuleCellProgenitors，GNPs)、提取自Ptch1+-自发MB小鼠的原代MB细胞以及3T3/GLI-luc细胞作为研究对象;给予指定浓度的PAB或SMO激动剂SAG处理，部分实验采用SMO抑制剂cyclopamine或vismodegib作为阳性对照;MTT法检测细胞活力，克隆形成实验或EdU掺入实验检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，westernblotting法检测凋亡相关蛋白、Gli1、cyclinD1、N-myc以及SMO蛋白表达，肿瘤球形成实验检测细胞成球能力，荧光素酶报告基因检测试剂盒检测GLI转录活性，qRT-PCR法检测Hh通路靶基因表达，siRNA敲低SMO后采用MTT法检测细胞活力，westernblotting法检测细胞Gli1、cyclinD1、N-myc及SMO蛋白表达。此外，我们构建了过表达SMO-GFP的NIH3T3细胞、过表达SMO-WT的293T细胞以及分别过表达SMO-WT、SMO-D477G、SMO-W539L的3T3/GLI-luc细胞，给予指定浓度PAB或SAG处理，部分实验采用vismodegib作阳性对照。此外，我们采用分子对接预测PAB与SMO的结合潜力，BODIPY-cyclopamine竞争结合实验检测PAB竞争结合SMO，CETSA实验检测PAB对SMO稳定性的影响，荧光素酶报告基因检测试剂盒检测Hh通路转录因子GLI转录活性，纤毛发生及SMO纤毛定位实验检测纤毛形成和SMO纤毛定位，westernblotting检测Gli1蛋白表达。在体内实验中，我们采用提取自Ptch1+-自发MB小鼠的原代MB细胞，构建MB异位移植瘤BALB/c裸鼠模型;肿瘤体积达100mm3时随机分为4组:溶剂空白对照组、PAB低剂量组(50mg/kg)、PAB高剂量组(100mg/kg)、vismodegib组(20mg/kg);隔日测量肿瘤体积及小鼠体重，持续给药18天后，取材留取肿瘤组织样本;称量肿瘤质量，westernblotting检测凋亡和增殖相关蛋白以及Gli1蛋白，qRT-PCR检测Hh通路靶基因表达，免疫组化法检测Ki-67表达水平，H&E染色观察组织病理形态。<br>　　结果:<br>　　在体外实验中，PAB对DAOY细胞表现出极显著的细胞毒效应，而且与其他肿瘤细胞系相比，PAB以极低的浓度特异性杀伤Hh通路高度活化的DAOY细胞(IC50为0.83μM)，同时抑制其克隆形成，并上调其凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3及PARPcleavage水平，诱导细胞凋亡;与之相一致的是，PAB同样可抑制原代MB细胞的细胞活性，显著减少EdU阳性细胞比例，并抑制其肿瘤球形成;然而，当我们采用siRNA敲低SMO后，DAOY细胞增殖能力降低，而且PAB无法有效抑制其增殖能力。在通路活性抑制效应方面，PAB可消除由SAG诱导的GLI荧光素酶报告基因以及Hh通路靶基因Gli1、cyclinD1、N-myc的转录活化;与此同时，PAB可下调DAOY细胞在SAG诱导前后的Gli1蛋白水平，并抑制其Gli1、cyclinD1的转录活性;同样地，PAB可抑制原代MB细胞Hh通路靶基因Gli1、cyclinD1、N-myc的转录水平;与之相一致的是，PAB可下调DAOY细胞及原代MB细胞Hh通路效应蛋白cyclinD1及N-myc的表达水平;而采用siRNA敲低原代MB细胞SMO后，PAB对其Gli1、SMO、cyclinD1及N-my蛋白的下调效应几乎消失。在通路靶点验证方面，虽然PAB对DAOY细胞总SMO蛋白水平并无影响，但是分子对接预测出PAB与SMO结合的两个位点，其中一个位点位于SMO跨膜区域(Transmembranedomain，TMD)的细胞外入口处，另一个则位于TMD的细胞内环区(Intracellularloops，ICLs)中;BODIPY-cyclopamine竞争结合实验结果表明PAB可与BODIPY-cyclopamine竞争结合SMOTMD中的疏水口袋，而CETSA实验亦证实PAB干预可提高SMO蛋白稳定性;PAB还可抑制细胞纤毛形成，但对SMO纤毛定位并无影响。在逆转耐药方面，PAB对过表达SMO-WT、SMO-D477G及SMO-W539L的3T3/GLI-luc细胞GLI转录活性呈现出相似的抑制效应，同时能下调其Gli1蛋白水平;此外，PAB对不同浓度梯度SAG处理下3T3/GLI-luc细胞的GLI转录活性的抑制效应几乎一致。在体内实验中，PAB显著抑制MB异位移植瘤的生长，且对小鼠体重无影响，同时上调其PARPcleavage、cleaved-casepase-3蛋白水平，肿瘤组织H&E染色片中亦观察到核凝集现象;此外，PAB还可下调肿瘤组织中PCNA及Ki-67表达水平;与体外实验相一致的是，PAB可下调肿瘤组织中Gli1蛋白水平，并下调其Gli1、cyclinD1、N-myc的mRNA水平。<br>　　结论:<br>　　本课题探讨了天然小分子化合物土荆皮乙酸抑制髓母细胞瘤生长的潜在分子机制。我们发现PAB可通过抑制Hh通路活性，在体外及体内抑制MB的生长。此外，PAB还可克服由SMO突变引起的SMO抑制剂耐药。通过机制研究，我们发现PAB可同时结合SMO上的两个位点，并抑制纤毛形成，提示PAB可通过多个机制抑制Hh通路的活性。因此，PAB是治疗Hh通路驱动的MB的有效药物，尤其是对SMO抑制剂产生耐药的MB，为新型Hh靶向药物的研发提供了新方向。