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摘要目的:<br>　　本研究通过细胞模型和斑马鱼感染模型，探究spvB通过调控Syk/PLCγ2途径抑制METs和NETs生成的分子机制，为进一步探索和揭示沙门菌的致病机制提供理论和实验依据。<br>　　方法:<br>　　一.spvB对巨噬细胞METs和中性粒细胞NETs生成的影响及分子机制研究<br>　　1.1spvB对METs和NETs生成的影响<br>　　用鼠伤寒沙门菌标准株SL1344野生型(wild type，WT)、敲除株ΔspvB和回补株ΔspvB/pspvB以感染复数(multiplicity of infection，MOI)20∶1与鼠巨噬细胞RAW264.7和诱导分化的人早幼粒细胞dHL-60共培养，感染2h后加入100U/mlDNase处理15min，用核酸荧光染料Hoechst染色后在荧光显微镜下观察胞外DNA丝状结构;用WT、ΔspvB和ΔspvB/pspvB以MOI20∶1与dHL-60共培养，感染2h后扫描电镜观察NETs;Western Blot检测1h(hour post infection，hpi)、2hpi和4hpi细胞中ETs相关蛋白肽基精氨酸脱氨酶-4（peptidyl arginine deiminase-4，PAD4）和瓜氨酸化组蛋白3(citrullinated histone3，CitH3)的表达水平;Picogreen dsDNA荧光定量法检测上清中dsDNA的含量。<br>　　1.2spvB影响METs和NETs生成的分子机制研究<br>　　用上述细胞感染模型，Western Blot检测1hpi、2hpi和4hpi细胞中p-Syk和p-PLCγ2的表达水平。<br>　　为确定Syk抑制剂Piceatannol作用的适宜浓度，分别用5μM、10μM、20μM、50μM和100μM Piceatannol预处理RAW264.7和dHL-602h，将WT与细胞以MOI20∶1共培养2h后Western Blot检测p-Syk、p-PLCγ2和PAD4的表达水平。为确定PLCγ2抑制剂U73122作用的适宜浓度，分别用0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、2μM和5μM的U73122预处理细胞30min，同上述细胞感染模型，Western Blot检测p-PLCγ2和PAD4的表达水平。<br>　　分别用50μM的Piceatannol和0.5μM的U73122预处理细胞，同上述细胞感染模型，2h后Hoechst染色荧光显微镜下观察胞外DNA丝状结构;Western Blot检测p-Syk和p-PLCγ2水平及PAD4和CitH3的表达;用Picogreen dsDNA荧光定量法检测上清中dsDNA的含量。<br>　　二、spvB对斑马鱼幼鱼ETs和METs生成的影响及分子机制研究<br>　　2.1 spvB对斑马鱼幼鱼ETs生成的影响<br>　　用109CFU/ml WT和ΔspvB浸染5d(days post fertilization，dpf)的斑马鱼幼鱼，Western Blot检测6hpi、8hpi和10hpi幼鱼中PAD4和CitH3的表达水平。<br>　　2.2 spvB对斑马鱼幼鱼METs生成的影响<br>　　用109CFU/ml表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的GFP-WT和GFP-ΔspvB，浸染5dpf巨噬细胞表达mcherry红色荧光的转基因斑马鱼幼鱼Tg(mpeg∶mcherry)，在收样前30min加入核酸荧光染料SYTOX Blue，于6hpi用细胞成像仪观察METs生成情况。<br>　　2.3 spvB影响斑马鱼幼鱼ETs生成的分子机制研究<br>　　用109CFU/ml WT和ΔspvB浸染5dpf的斑马鱼幼鱼，Western Blot检测6hpi、8hpi和10hpi幼鱼中p-Syk和p-PLCγ2的表达水平。<br>　　为确定在斑马鱼体内模型中Piceatannol作用的适宜浓度，分别用浓度为5μM、10μM、20μM、50μM、100μM和200μM的Piceatannol预处理5dpf斑马鱼幼鱼2h，用109CFU/ml WT浸染斑马鱼幼鱼，Western Blot检测6hpi p-Syk和PAD4的表达水平。为确定在斑马鱼体内模型中U73122作用的适宜浓度，分别用0.05μM、0.1μM、0.2μM和0.5μM的U73122预处理斑马鱼幼鱼30min，同上述斑马鱼感染模型，Westem Blot检测p-PLCγ2和PAD4的表达水平。<br>　　分别用适宜浓度的Piceatannol和U73122预处理5dpf斑马鱼幼鱼，同上述斑马鱼感染模型，Western Blot检测6hpi幼鱼中p-Syk和p-PLCγ2水平及PAD4和CitH3的表达。<br>　　结果:<br>　　一、spvB对巨噬细胞METs和中性粒细胞NETs生成的影响及分子机制研究<br>　　1.1 spvB对METs和NETs生成的影响<br>　　将WT、ΔspvB和ΔspvB/pspvB以MOI20∶1与Raw264.7和dHL-60共培养，2h后荧光显微镜结果显示，DNase未处理时ΔspvB组胞外DNA丝状结构显著多于WT组和ΔspvB/pspvB组:DNase处理后三组的胞外DNA结构均消失。用WT、ΔspvB和ΔspvB/pspvB以MOI20∶1与dHL-60共培养，2h后扫描电镜结果显示，ΔspvB组NETs生成量多于WT组及ΔspvB/pspvB组。Western Blot检测1hpi、2hpi和4hpi两种细胞模型中PAD4和CitH3表达水平，RAW264.7细胞感染模型结果显示，2hpi和4hpiΔspvB组PAD4的表达水平明显高于WT组和ΔspvB/pspvB组，1hpi和2hpi CitH3的表达水平明显高于WT组和ΔspvB/pspvB组（**P＜0.01）。<br>　　1.2 spvB影响METs和NETs生成的分子机制研究<br>　　用上述细胞感染模型，Western Blot检测1hpi、2hpi和4hpi细胞中p-Syk和p-PLCγ2的表达水平。结果显示1hpi和2hpiΔspvB组p-Syk的表达水平均高于WT组和ΔspvB/pspvB组（*P＜0.05）;4hpi二组间p-Syk的表达水平无统计学差异。1hpi三组间p-PLCγ2的表达水平无统计学差异;2hpi和4hpiΔspvB组p-PLCγ2的表达水平均高于WT组和ΔspvB/pspvB组(*P＜0.05)。<br>　　用不同浓度梯度的Piceatannol和U73122预处理细胞后，根据Western Blot结果选择Piceatannol浓度为50μM和U73122浓度为0.5μM用于后续实验。<br>　　二、spvB对斑马鱼幼鱼ETs生成的影响及分子机制研究<br>　　2.1 spvB对斑马鱼幼鱼ETs生成的影响<br>　　用109CFU/ml WT和ΔspvB浸染5dpf斑马鱼幼鱼，Western Blot检测6hpi、8hpi和10hpi幼鱼中PAD4和CitH3的表达水平。结果显示ΔspvB组PAD4和CitH3表达水平均高于WT组（*P＜0.05）。以上结果说明spvB抑制ETs生成。<br>　　2.2 spvB对斑马鱼幼鱼METs生成的影响<br>　　用109CFU/ml GFP-WT和GFP-ΔspvB浸染5dpf转基因斑马鱼幼鱼Tg(mpeg∶mcherry)，SYTOX Blue染色后通过细胞成像仪观察6hpi斑马鱼体内METs生成情况。结果显示GFP-WT组和GFP-ΔspvB组均有红色荧光的巨噬细胞、绿色荧光的细菌和蓝色胞外DNA重合的部分，即METs结构;且GFP-ΔspvB组的METs结构比GFP-WT组多，说明spvB抑制斑马鱼幼鱼METs生成。<br>　　2.3 spvB影响斑马鱼幼鱼ETs生成的分子机制研究<br>　　用109CFU/ml WT和ΔspvB浸染5dpf的斑马鱼幼鱼，Western Blot检测6hpi、8hpi和10hpi幼鱼中p-Syk和p-PLCγ2的表达水平。结果显示6hpi、8hpi和10hpiΔspvB组p-Syk的表达水平均高于WT组（*P＜0.05）。6hpiΔspvB组p-PLCγ2的表达水平高于WT组（*P＜0.05），8hpi和10hpi两组间p-PLCγ2的表达水平无统计学差异。<br>　　用不同浓度梯度的Piceatannol和U73122预处理斑马鱼后，根据Western Blot结果选择Piceatannol浓度为200μM和U73122浓度为0.5μM用于后续实验。<br>　　分别用上述适宜浓度的抑制剂预处理斑马鱼感染模型后，Western Blot检测结果显示，Piceatannol和U73122预处理组p-Syk、p-PLCγ2、PAD4和CitH3的表达水平均低于Piceatannol和U73122未处理组（*P＜0.05）。说明spvB通过调控Syk/PLCγ2抑制斑马鱼ETs生成。<br>　　结论:<br>　　1.沙门菌质粒毒力基因spvB抑制巨噬细胞METs和中性粒细胞NETs生成。<br>　　2.沙门菌质粒毒力基因spvB调控Syk/PLCγ2抑制METs和NETs的生成。