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摘要目的:<br>　　修复神经损伤的关键条件之一是轴突再生，再生的轴突达到效应器并形成有效的突触联系是功能恢复的前提。中枢神经系统(Central nervous system，CNS)再生困难仍是当代医学面临的一大难题，损伤后的轴突启动修复程序对轴突再生起到关键的作用。力学拉伸(Mechanical stretching，MS)通过作用神经细胞产生机械刺激，进而产生强大的轴突再生作用，但是轴突如何感受MS刺激，受到拉伸刺激的轴突又通过影响何种分子产生再生效果尚不可知。因此，本课题拟通过对损伤的轴突施加MS刺激，运用细胞免疫荧光、蛋白定量等技术，探究MS刺激促进轴突再生的分子机制。<br>　　方法:<br>　　1.本研究采用体外神经细胞拉伸模型，将背根神经节(Dorsal root ganglion，DRG)神经元种植在弹性培养皿上，通过对DRG神经元施加MS刺激3天，运用神经元特异性标记物荧光染色，检测荧光强度及轴突长度，以此判断模型建立。<br>　　2.对受到MS刺激的DRG神经元进行蛋白筛选，运用Western Blot技术检测DRG神经元中再生相关以及机械敏感相关蛋白，选出可能受MS刺激改变的蛋白。<br>　　3.对受到MS刺激的DRG神经元进行免疫共染，同时标记神经元与再生相关蛋白，检测再生相关蛋白与MS促进轴突再生的相关性。<br>　　4.对体外培养的DRG神经元使用GSK205处理3天(GSK205，TRPV4特异性抑制剂)，再对其进行特异性抗体免疫荧光染色，统计轴突长度。<br>　　5.将TRPV4特异性小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)与增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)质粒混合物，通过电穿孔转染标记DRG神经元，敲减TRPV4后继续培养3天。检测siRNA敲减效率并统计轴突长度。<br>　　6.将TRPV4特异性siRNA与EGFP质粒混合后注射到小鼠体内第四、五腰椎(Lumbar4-5，L4-5)DRG神经元中，标记坐骨神经感觉神经纤维，电穿孔2天后损伤坐骨神经，5天后，取出标记侧的坐骨神经进行压片，测量轴突再生长度。<br>　　7.对体外培养的DRG神经元进行降低TRPV4蛋白处理(敲减TRPV4或抑制TRPV4蛋白表达)，培养3天后检测PTEN蛋白变化水平。<br>　　8.向敲减TRPV4的DRG神经元加入PTEN激活剂(Oroxin B)，培养3天后检测轴突再生情况。<br>　　结果:<br>　　1.受到MS刺激3天后，与Ctrl组相比，MS组的DRG神经元轴突长度以及相同区域内荧光强度均有较为明显的增加，表示轴突受到MS刺激再生。<br>　　2.受到MS刺激3天，Western Bolt检测显示TRPV4、PTEN、C-MYC蛋白表达量显著改变，提示TRPV4、PTEN可能与拉伸后的轴突再生相关。TUJl分别与TRPV4、PTEN特异性抗体共染，证实MS刺激可以引起DRG神经元TRPV4、PTEN蛋白的表达显著变化。<br>　　3.分别使用TRPV4特异性抑制剂GSK205、特异性TRPV4的siRNA降低DRG神经元表面的TRPV4蛋白表达，可以显著促进DRG神经细胞轴突再生。<br>　　4.体外敲减TRPV4，损伤的坐骨神经轴突明显再生。<br>　　5.敲减TRPV4或抑制TRPV4蛋白，PTEN蛋白表达明显下降。<br>　　6.激活PTEN蛋白使敲减TRPV4的轴突再生受到抑制。<br>　　结论:<br>　　力学拉伸刺激通过降低神经细胞中TRPV4表达促进再生，降低的TRPV4蛋白可能通过抑制PTEN活性调控轴突再生。