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摘要目的<br>　　脂肪酸酰胺水解酶(Fattyacidamidehydrolase，FAAH)作为生物内源性大麻素主要水解酶之一并广泛存在于神经系统中，可以通过调控N-花生四烯酸乙醇胺(N-arachidonoyl-ethanolamine，AEA)的降解，对细胞的增殖、凋亡和分化等产生影响。一些临床研究表明，在镇痛、抗惊厥等疾病的治疗也发挥着很好的效果。因此，在本研究中，我们主要探讨的是神经损伤后FAAH和AEA对神经轴突再生的调控作用。<br>　　方法<br>　　1.坐骨神经切断(Axotomy)1天、3天和7天后，取背根神经节(Dorsalrootganglion，DRG)组织进行免疫蛋白印迹(Westernblot)和免疫荧光染色实验，检测DRG组织中FAAH的表达量变化。<br>　　2.DRG神经元体外培养:取小鼠DRG组织，经胶原酶和胰酶分别消化90分钟和15分钟后，用含有10％FBS的MEM培养基终止消化并吹散DRG神经元细胞，离心使细胞沉淀，并用含有5％FBS的MEM培养基吹散沉淀，使细胞悬浮于培养基中，最后接种于24孔培养板中。<br>　　3.建立体外轴突切断模型(Cellreplatingmodel):在体外培养DRG神经元3天后，去除孔中培养基，用新的含有5％FBS的MEM培养基轻微吹打贴附于孔壁上细胞，使其脱落并悬浮于培养基中，最后重新接种于新的24孔培养板，继续培养20小时。<br>　　4.坐骨神经切断7天后取DRG组织进行体外培养，加入FAAH选择性抑制剂URB597或添加外源性AEA。培养24小时后，通过免疫荧光标记轴突并统计神经轴突再生长度。<br>　　5.坐骨神经切断同时，将FAAH特异性siRNA和绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)质粒的混合物转染入DRG神经元，进而抑制受损神经元内的FAAH基因表达，3天后取出DRG组织进行体外培养，培养24小时后通过免疫荧光标记轴突并统计再生长度。<br>　　6.将FAAH特异性siRNA和GFP质粒的混合物转染入于第四和五腰椎(Lumbar4-5，L4-L5)DRG内，第三天后进行坐骨神经夹伤，第五天取坐骨神经进行压片并统计轴突再生长度并进行Westernblot检测敲减效率。<br>　　7.体外培养DRG神经元细胞时，用FAAH选择性抑制剂URB597和外源性AEA干预，培养结束后通过鬼笔环肽染色判断F-肌动蛋白(F-actin)分布。<br>　　8.液相色谱一质谱(HPLC-MS/MS)检测加入抑制剂URB597后，DRG神经元体外培养中的AEA含量。<br>　　结果<br>　　FAAH通过调控AEA影响神经轴突再生<br>　　1.小鼠坐骨神经切断后，DRG神经元中FAAH的免疫荧光量和蛋白表达升高;<br>　　2.Axotomy后，抑制FAAH或添加外源性AEA后，DRG神经元的轴突再生受到抑制;<br>　　3.通过体外轴突切断结果显示，应用FAAH选择性抑制剂URB597或添加外源性AEA后，抑制轴突再生;<br>　　4.将特异性siRNA和GFP质粒混合物转染入L4-L5DRG中，坐骨神经轴突再生受到抑制;<br>　　5.FAAH通过降解外周神经中AEA的表达量，调控神经再生。<br>　　6.抑制FAAH活性或添加外源性AEA，能够降低生长锥中F-肌动蛋白分布，达到抑制神经轴突再生的作用。<br>　　结论<br>　　神经损伤后的轴突再生是一个非常复杂的生物学过程，其中基因表达模式改变是其调控的基础。因此，轴突再生相关蛋白表达情况是非常重要的研究。通过本研究的实验结果我们发现，坐骨神经切断后，DRG组织中FAAH表达量会升高，并且抑制FAAH或添加外源性AEA，可以阻碍受损神经元轴突再生。通过质谱分析，我们证明了FAAH是通过降解外周神经中AEA的浓度，达到调控受损神经的轴突再生过程。此外，我们发现抑制FAAH或添加外源性AEA，能够降低生长锥中的F一肌动蛋白的分布，达到抑制外周神经轴突再生的作用。